PLGA神經導管聯合ADSCs與自體神經組織修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究

陳軍　王靜　張兆鋒等

[摘要]目的：探討PLGA神經導管聯合ADSCs與自體神經組織碎屑修復大鼠坐骨神經缺損的修復效果。方法：32只SD大鼠平均分成4組，無菌條件下切斷右側的坐骨神經，制成10mm長的大鼠坐骨神經缺損模型，A組采用PLGA神經導管連接缺損神經進行修復，B組由內置自體神經組織碎屑的PLGA神經導管連接，C組由內置ADSCs與自體神經組織碎屑的PLGA神經導管連接，D組采用自體神經移植方式。12周后通過對再生神經橋接體的一般觀察、HE染色、免疫熒光染色、甲苯胺藍染色來評價神經的再生情況；通過肌電圖、腓腸肌的HE和Masson染色來評價神經對靶器官的再支配情況。結果：術后12周，各組的神經導管均已降解，切斷神經通過神經導管向兩端生長。一般觀察、肌電圖、組織學觀察結果均提示PLGA神經導管聯合ADSCs與自體神經組織碎屑組C組的修復效果顯著優于內置神經組織碎屑的PLGA神經導管組B組和空導管組A組的修復效果，但仍稍差于自體神經移植組D組。結論：PLGA神經導管聯合ADSCs與自體神經組織可以比較有效地修復周圍神經缺損，為周圍神經缺損的修復提供了一種新的方法。

[關鍵詞]周圍神經缺損；神經組織碎屑；脂肪干細胞；聚乳酸羥基乙酸；神經導管

[中圖分類號]R745 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0060-06

周圍神經缺損是臨床上常見的疾病，外傷、手術操作、腫瘤切除等均會導致周圍神經缺損的發生，對于普通的神經離斷損傷可以在無張力的條件下用端端吻合的方法修復。而對于較長節段神經缺損的修復，目前的金標準是自體神經移植，但是自體神經移植具有供區來源有限、二次損傷、供區的感覺功能障礙、供區和受區神經結構和粗細不匹配等缺點。鑒于自體神經移植的諸多限制，組織工程神經導管應運而生，人們早期曾使用空腔靜脈導管修復周圍神經缺損，后來有學者采用在靜脈內填充神經碎屑來修復周圍神經缺損，均取得了比較好的修復效果。近年來聚乳酸羥基乙酸（poly-lactic-co-glycolic-acid，PLGA）神經導管以其優越的性能受到學者們的重視且已被廣泛應用于各研究中，其性能也得到進一步完善，如對導管進行甲殼素涂層來改善導管的生物學性能；在導管內置入纖維絲改善神經導管的內部空間結構等。有研究發現PLGA材料復合雪旺細胞、細胞生長因子、間充質干細胞或脂肪干細胞（adipose derived stem ceils，ADSCs）后能促進軸突的再生和髓鞘的形成以及神經功能的恢復。本實驗設計以PLGA神經導管為支架材料，將自體來源的神經碎屑，復合ADSCs填充到神經導管中，探討此種聯合自體神經組織和ADSCs的具有內部空間結構的神經導管修復周圍神經缺損的效果。

1材料和方法

1.1材料與設備：健康成年SD大鼠32只，雌性，體重200～250g（上海斯萊克動物實驗有限公司）；5～7d SD乳鼠若干只，體重（16.0±2.1）g（上海斯萊克動物實驗有限公司）。

DMEM培養基（Hyclone）、復合膠原酶NB4（Serva，Germany）、胎牛血清（Hyclone，Australia）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、0.2 5%trypsin-EDTA（Gibco，Canada）、兔抗單克隆neurofilament-H（Millipore，USA）、兔抗S100單克隆抗體（Dako，Denmark）、驢抗兔IgG抗體（Invitrogen，USA）、Masson染色試劑盒（Leagene）、Calcein-AM（上海麥約爾生物技術有限公司）、甲苯胺藍。PLGA導管材料由東華大學提供。

倒置相差顯微鏡（Olympus，Japan）、恒溫CO₂培養箱（Forma Scientific，USA）離心機（Thermo，USA）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，中國）、正置顯微鏡（Nikon 90i，Japan）、Evos顯微鏡（Life，USA）、熒光顯微鏡（Nikon，Japan）、冰凍切片機（Shandon Cryotome FSE，Thermo scientific，British）、Key point多道肌電圖儀（Dantec，丹麥）、石蠟切片機（Shandon Finesse 325，Thermo Shandon Ltd.，British）、解剖顯微鏡（Motic，USA）、顯微外科手術器械（上海手術器械廠，中國）。

1.2實驗方法

1.2.1 PLGA神經導管的準備：取PLGA神經導管，環氧乙烷消毒，真空包裝備用。

1.2.2 ADSCs的取材、培養、觀察和鑒定：將5～7d SD乳鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精中浸泡5min后，無菌條件下取其腹股溝皮下脂肪組織，置入培養皿中，向皿中加入含2%FBS的冷PBS洗去血液。將脂肪塊剪碎至約1mm³大小，向培養皿中加入0.2%復合膠原酶NB4（用DMEM培養基配制），轉移至一次性離心管中，放入37℃、5%CO₂培養箱中孵育。每隔5min振蕩1次，消化約1.5h，反復吹打約5min，使組織充分分散。以1500rpm、37℃、離心5min，棄去上清，加入含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，按大約1×10³/cm²密度將細胞接種到培養皿中，置于37℃、5%COz培養箱培養。待原代細胞長滿至培養皿的80%左右，吸去上清液，PBS漂洗后，加37℃、0.25%trypsin-EDTA消化約1min，輕輕拍打培養皿使細胞從皿底脫離，加入含血清的DMEM培養基終止消化，收集所得細胞，以1500rpm、37℃、離心5min，培養液重懸，按1：2的比例傳代接種，置于37℃、5%CO₂培養箱繼續培養，每48h換液一次，待細胞增殖至覆蓋皿底80%時，用同樣方法傳代，傳至第三代，行Calcein-AM熒光染色后鏡下進行細胞形態學觀察，參照張怡等的實驗方法對脂肪干細胞行CD29和CD44細胞流式技術鑒定，并對脂肪干細胞培養備用。

1.2.3神經組織雪旺細胞遷出實驗和鑒定：將5～7d SD乳鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精中浸泡5min后，沿大腿后外側入路，無菌條件下切開皮膚，分離肌肉，暴露并切取雙側坐骨神經，存放在冰板上的培養皿中，解剖顯微鏡下仔細去除神經外膜，PBS緩沖液反復沖洗3次。用組織剪將其剪碎至約0.5～1mm³大小置于培養皿中，加入適量含10%FBS的DMEM培養基，使培養基剛好浸沒組織塊，置入含5%CO₂的37℃培養箱培養，24h后待組織塊基本牢固的貼附在培養皿底部時追加培養基，每日觀察。每48h換液一次。待組織塊周圍細胞長滿后，將組織塊轉移至新的培養皿中繼續培養，遷移出的雪旺細胞消化、純化后行S100染色鑒定。

1.2.4 PLGA神經導管的預處理：動物實驗進行的前一天，取真空包裝的無菌PLGA神經導管，用含體積分數為10%胎牛血清的培養基預置24h，以增加細胞黏附性，備用。

1.2.5實驗分組及神經導管制備：SD大鼠32只，隨機分為4組，每組8只。B，c組填充的自體神經來源于切除的坐骨神經，剪取約1/3神經組織剪成碎屑后疏松充填于神經導管中；將收集的ADSCs配成1×10⁷/ml的細胞懸液，注入充填自體神經組織碎屑的C組PLGA神經導管中。

1.2.6手術方法：將已分組大鼠行3%異戊巴比妥鈉（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，無菌條件下于右股后外側行縱切口，自肌間隙進入，暴露大鼠右側坐骨神經。自梨狀肌下緣切除7mm坐骨神經，兩端回縮后造成lOmm神經缺損。A組直接采用PLGA神經導管連接缺損神經，顯微鏡下將神經的兩斷端分別套入導管1mm，以10-0顯微外科縫線4針固定，分層縫合肌肉和皮膚；B組由內置自體神經組織碎屑的PLGA神經導管連接；C組由內置ADSCs與自體神經組織碎屑的PLGA神經導管連接；D組于坐骨神經中段切取10mm，旋轉180°后行端端縫合。術后，將動物置于復蘇室中待其蘇醒，常規用青霉素抗感染治療3d，動物房內分籠飼養。

1.3觀察指標

1.3.1一般情況：術后觀察記錄大鼠飲食、精神狀態、足部潰瘍、肢體活動、自噬現象、傷口有無感染及愈合情況。

1.3.2觀察缺損修復部位：術后12周后，按原手術入路暴露。觀察神經導管的降解情況，吻合口有無神經瘤形成，再生神經橋接體的形態，與周圍組織有無粘連，炎性反應的程度以及腓腸肌的形態大小等。

1.3.3肌電圖檢測：于暴露部位，采用肌電圖儀檢測肌肉復合動作電位（CMAPs），以3.5mA、0.05ms、3Hz的電刺激分別于神經吻合口的近端進行刺激，誘發動作電位，并記錄動作電位峰值（peak amplitude），肌肉復合動作電位潛伏期（1atency）肌電圖檢查后，處死大鼠并取材。

取神經橋接體和腓腸肌分別制作冰凍切片和石蠟切片行大體觀察、組織化學染色觀察及圖像分析。

1.3.4再生橋接體的HE、S100、NF和甲苯胺藍染色：再生的神經橋接體取材后，先置于蔗糖質量體積分數為10%的4%多聚甲醛溶液中固定2h，然后轉移至質量體積分數為30%的蔗糖溶液48h，OCT組織包埋劑包埋后制作冰凍切片，切片厚度為8Pm，取橋接體的中段行HE染色、S-100染色、NF染色和甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察神經組織的再生情況。

1.3.5腓腸肌的HE～Masson染色：將取下的腓腸肌置于4%多聚甲醛液固定24h，酒精梯度脫水，石蠟包埋切片后行HE染色和Masson染色，觀察肌纖維的分布和大小，纖維化的程度；測量并計算肌纖維的橫截面積和纖維化的比例。

1.4統計學方法：每組數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 ADSCs的形態觀察及流式細胞技術鑒定：培養72h后，相差顯微鏡下觀察，細胞已完全貼壁，充分伸展呈梭形，多角形，部分區域形成細胞團簇，周圍偶可見少量圓形且發亮的脂滴（圖1a、b、c）。經CD29和CD44流式細胞技術鑒定，所獲取的細胞為高純度的ADSCs。

2.2雪旺細胞遷出實驗觀察及S100鑒定：可見從組織塊中遷移出大量的呈梭形，有雙極或三極突起，突起細長，中部較亮，折光性強，胞體飽滿，胞核明顯、呈卵圓形的細胞，符合雪旺細胞的形態特征（圖1d、e），且經S100鑒定呈陽性（圖1f）。隨著時間推移，組織塊中遷出的雪旺細胞的數量逐漸增多，組織塊的體積逐漸減小。

2.3 PLGA神經導管大體觀察及橋接神經缺損觀察：神經導管長10mm，內徑1.8mm，管壁厚度200μm，為多孔的結構，孔隙大小50～100μm，具有較好的機械強度和韌度（圖2a）。神經導管置入后，與神經缺損的兩斷端接合良好（圖2b）。

2.4大體觀察：術后大鼠飲食正常，手術傷口均一期愈合，大鼠術側的肢體活動障礙，足趾出現蜷曲畸形。術后兩周各組大鼠患側出現不同程度的足部腫脹和潰瘍，且A組的潰瘍程度要比B、C、D組大。C、D組大鼠的足部潰瘍在5～6周時基本愈合，B組在6～7周時基本愈合，A組在8～9周時基本愈合，12周時所有大鼠的足部潰瘍已全部愈合，大鼠全部存活。12周時按原來的手術入路暴露修復部位，可見神經導管已降解，再生神經橋接體與周圍組織無明顯粘連，表面可見毛細血管網形成，兩端與坐骨神經相連接，吻合口處可見縫線，再生神經中間略細，兩端略膨大但未見明顯神經瘤形成（圖2c）。

2.5神經電生理結果：在設定的刺激參數下，術后12周各組均檢測出動作電位。各組動作電位的峰值大小依次為A組B組>c組>D組，且各組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）（圖3b）。

2.6神經橋接體的HE、S-100、NF及甲苯胺藍染色觀察：術后12周HE染色可見A組的組織分布較為稀疏、紊亂，而B、C、D組的組織分布較為致密、有序且C、D組相較于B組更為致密、有序，偶可見到少量的炎性細胞浸潤（圖4 HE）。S-100和NF染色提示C、D組的雪旺細胞的數量和軸突的數量最多，B組的次之，A組的最少（圖4 S100、NF）；甲苯胺藍染色顯示D組的有髓神經纖維的數量最多，形態最為規則，C組次之，B組和A組差于C組（圖4 TB）。

2.7腓腸肌的HE和Masson染色：術后12周染色可見B、C、D三組的肌纖維致密且粗大，肌細胞形態比較飽滿，纖維化程度低，而A組的肌纖維相對稀疏，細胞有所萎縮，可見比較明顯的纖維化（圖5 HE和Masson）。C組肌纖維平均橫截面積稍小于D組（P<0.05），但C、D兩組的肌纖維平均橫截面積均明顯大于A、B兩組（P

3討論

周圍神經損傷后，斷端遠側段神經纖維的髓鞘及軸突崩解，并被雪旺細胞和巨噬細胞吞噬，發生瓦勒變性（Wallerian degeneration），近側端也發生類似變化。兩端雪旺細胞均分裂增殖形成BUngner帶，近端的軸突每天以一定的速度生長，在神經遠端趨化因子作用下，在一定距離內再生軸突沿著BUngner帶向前延伸并到達神經的遠端。數十年來研究者們不斷探索應用各種材料的神經導管復合種子細胞修復周圍神經缺損。本實驗在既往課題組應用PLGA神經導管修復周圍神經缺損的研究基礎上進行改良，向PLGA導管內充填自體神經組織碎屑和ADSCs來構建細胞神經組織及生物材料形成的人工神經橋接周圍神經缺損。

在體外神經組織雪旺細胞遷出實驗中發現，將離體的神經組織剪成約0.5～1mm³大小的碎屑，雪旺細胞可以逐漸從組織塊中遷移出，且隨著時間的變化，從組織塊中遷出的雪旺細胞逐漸增多，在其他學者的研究中也有類似發現。雪旺細胞作為周圍神經再生最重要的種子細胞，不僅參與吞噬變性的軸突和髓鞘的形成，還分泌多種細胞外基質（ECM）成分和神經營養因子，包括NGF，BDNF，GDNF等，可以引導軸突的定向生長，在軸突再生后包繞神經軸突，促進再生神經的成熟，調節神經肌肉突觸活動。以往研究多采用異體雪旺細胞在體外培養擴增后加入神經導管內，由于雪旺細胞培養增殖要求較高，涉及酶消化，純化，鑒定及擴增，接種后存在一定的排異反應，存活的細胞數量和功能都較低。本實驗設計直接將自體神經組織碎屑剪碎后充填于神經導管中，在通透性良好的PLGA導管內，神經組織碎屑很容易固定在導管內壁，類似體外培養皿內神經組織碎屑培養環境，因此推測在大鼠體內不僅產生的雪旺細胞數量有保障，且無異體雪旺細胞可能出現的排斥反應和功能降低。本實驗還充分利用自體神經碎屑的基質成份作為內部支架結構，為細胞的粘附和軸突的生長提供支持和引導。體外實驗發現神經組織塊在培養過程中隨著雪旺細胞的遷移體積逐漸變小，表明其可在神經再生過程早期于神經導管內部作為支架材料，防止導管塌陷，后期隨著體積逐漸縮小亦有利于再生神經軸突通過。在臨床工作中若切取少量神經斷端組織、較不重要區域的神經組織、抑或是切除下的痛性神經瘤組織，充分剪碎后將其充填于神經導管中，一方面可作為種子細胞的來源，另一方面作為內部支架材料也是可行的。

周圍神經損傷后再生過程中，雪旺細胞合成分泌多種神經營養因子及其他細胞粘附分子，并與相鄰軸突形成縫隙連接或緊密連接，是許多小分子物質和信息傳遞的直接通道，其數量和功能是相當重要的，但在損傷早期很難達到所需濃度。然而有研究者將ADSCs移植到周圍神經損傷處，發現其可促進周圍神經的再生。ADSCs具有多向分化潛能特性，ADSCs多次傳代后，仍具有正常的2倍體核型，且不隨傳代次數增加而發生明顯改變。此外，ADSCs來源廣泛、分離培養方法簡單、擴增能力強、低水平衰老、低免疫性等特點，使其成為促進神經再生的重要細胞來源。Tomita等將人的ADSCs體外誘導形成雪旺細胞樣細胞，證實誘導分化的細胞可以像人類雪旺細胞一樣分泌BDNF、NGF，甚至分泌的GDNF比雪旺細胞還要多，將誘導分化的帶有GFP標記的ADSCs注射到脛神經嵌壓傷的大鼠體內，8周后可看到1/3的細胞存在于周圍軸突中，產生髓鞘蛋白，并促進髓鞘的生成，證明了ADSCs經誘導形成的雪旺細胞樣細胞可促進周圍神經再生。Kingham等將誘導分化的ADSCs移植到大鼠坐骨神經橫斷損傷處，2周后發現移植組大鼠的坐骨神經再生的軸突長度較對照組長。此外，雪旺細胞和ADSCs在神經修復的過程中可能存在協同作用。Sowa等證實含有ADSCs分泌的細胞因子的培養基能夠支持雪旺細胞的存活和增殖。Dai等發現雪旺細胞聯合ADSCs修復周圍神經缺損的效果要優于單純應用雪旺細胞的修復效果。而對于在神經損傷處移植ADSCs的濃度及其分化程度研究者還存在一定的爭論。

本實驗先將自體神經碎屑充填于PLGA神經導管內，然后再將體外環境下分離和培養的ADSCs植入導管內，細胞濃度為1×10⁷/ml，來修復大鼠坐骨神經缺損，于12周取材后發現，神經導管聯合ADSCs和自體神經組織碎屑組C組的神經再生與A、B組比較，C組的復合肌肉動作電位的峰值高，潛伏期短，再生神經的軸突直徑及髓鞘厚度均有優勢。C組大鼠腓腸肌的HE和Masson染色結果也證實大鼠再生神經的質量優于A、B組。本實驗研究結果與Gu等將ADSCs注射移植到硅膠管中修復大鼠坐骨神經缺損實驗結果相似，表明聯合ADSCs和神經組織碎屑的神經導管能促進周圍神經再生。

本實驗中所用的PLGA神經導管具有良好的生物相容性和可降解性，且為多孔的結構，不僅可以將導管內部的結構和神經斷端與周圍組織分隔，減少炎性組織的浸潤和減輕周圍組織的壓迫，還可以實現導管內的組織與周圍的環境進行物質交換和信息交流。

總之，PLGA神經導管聯合ADSCs與自體神經組織碎屑可以有效地修復大鼠坐骨神缺損，修復效果總體上雖稍差于自體神經移植，但我們相信隨著研究的深入，修復效果會得到更大程度的改善，甚至達到與自體神經移植修復相媲美的效果。