中國本土魚類模式生物稀有鮈鯽研究應用的歷史與現狀

王劍偉，曹文宣

中國科學院水生生物研究所，武漢 430072

中國本土魚類模式生物稀有鮈鯽研究應用的歷史與現狀

王劍偉*，曹文宣#

中國科學院水生生物研究所，武漢 430072

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是一種中國特有的小型鯉科魚類，從1990年開始，中國科學院水生生物研究所以培育新的實驗魚為目的，對稀有鮈鯽開展了系列的實驗動物化研究，并推動其在各研究領域中的應用。隨著我國化學品環境管理制度的建立，稀有鮈鯽已逐漸成為我國化學品測試中最重要的受試魚類。本文綜述了稀有鮈鯽分類地位、分布、形態特征、早期發育、生長、繁殖、遺傳、對環境的適應性等方面的生物學特點，分析了稀有鮈鯽作為模式生物的優點，介紹了稀有鮈鯽實驗動物標準制定進展。隨著實驗動物標準化工作的深入以及基因組測序工作的開展，稀有鮈鯽將更廣泛地應用于相關的研究和檢定，成為一種我國具有代表性的本土模式生物。

稀有鮈鯽；模式生物；生物學特點；實驗動物標準化

模式生物一直是遺傳學和現代生物學發展的基石之一。魚類作為低等的脊椎動物，大多有體外受精、體外發育、胚體透明、胚胎可大量獲得等優點，在生物學實驗研究中起著重要的作用。同時，魚類既是水生生物的代表性類群，又是水生態系統中的消費者，其對水環境的物理、化學變化敏感，是環境監測、水生態毒理學研究常用的試驗材料。從1990年開始，中國科學院水生生物研究所以培育新的實驗魚為目的，對稀有鮈鯽開展了系列的實驗動物化研究，并推動其在各研究領域中的應用。現在稀有鮈鯽已較多地應用于遺傳學[1]、魚病學[2]、生理學[3]、生物監測[4-5]、毒性測試[6-8]等領域，是我國化學品管理中推薦使用的本土受試生物。隨著實驗動物標準化研究的深入以及基因組測序工作的開展，稀有鮈鯽將更多更廣地應用于相關的研究和檢定，成為我國重要的魚類模式生物。

1 稀有鮈鯽簡介(Brief introduction to Gobiocypris rarus)

1.1 分類地位

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus Ye et Fu)，俗名青魚、金白娘，是1983年四川農業大學的葉妙榮和傅天佑在《動物分類學報》上發表的新屬新種，其模式標本采于四川省漢源縣九襄區流沙河[9]。由于形態特征與鯉科(Cyprinidae)細鯽屬(Aphyocypris)較為相似，稀有鮈鯽被歸到(魚丹)(Danioninae)亞科，但以無腹棱和背鰭起點位置較靠前而不同于細鯽屬，為此建立了新屬——鮈鯽屬(Gobiocypris)?！端拇~類志》[10]和《中國動物志·硬骨魚綱·鯉形目(中卷)》[11]均采用該分類觀點。稀有鮈鯽的英文名為rare minnow[12]，此外也有用Chinese rare minnow，raregudgeon等[13-14]。

隨著分子系統學的蓬勃發展，眾多的分子標記被應用到鯉科魚類的系統發育研究中。何舜平等[15]采用線粒體細胞色素b基因(cytb)研究鯉科魚類系統發育關系時發現，稀有鮈鯽與鮈亞科(Gobioninae)的魚類聚在一起。后來Yang等[16]和Liu等[17]對鮈亞科魚類的分子系統發育研究時發現，稀有鮈鯽與鮈亞科中頜須鮈屬(Gnathopogon)有較近的親緣關系，應歸屬于鮈亞科，支持了何舜平等[15]的觀點。

李小娟等[18]制作了稀有鮈鯽的透明骨骼標本，并選取47個外部及骨骼形態特征，與其他鯉科各亞科魚類的典型特征進行比較，建立分支分析的特征矩陣。研究結果發現，稀有鮈鯽以“副蝶骨背部平坦，無明顯突起，有眶蝶骨伸出的眶間隔向下直接延伸至副蝶骨；偽鰓動脈和鰓上動脈不相連接；上眶骨不發達，第五下框骨與上眶骨不連接；三叉顏面神經孔前孔位于前耳骨和蝶耳骨交匯處；烏喙骨骨片小，不發達，烏喙骨和匙骨之間的孔大；第2、3椎體愈合”等特征與鮈亞科魚類聚類在一起，進一步證明稀有鮈鯽應歸屬于鮈亞科。

1.2 分布區與生境特點

稀有鮈鯽野生種群分布于我國四川省的成都平原及其西部邊緣地區。1983年描述新屬新種的模式標本僅發現于四川省漢源縣流沙河，此后丁瑞華[10]在都江堰市柏條河采集到標本。在稀有鮈鯽實驗動物化研究中，中國科學院水生生物研究所先后在四川西部采集野生個體，相繼發現其在雙流市、彭州市、石棉縣等地的分布。2008年，在開展稀有鮈鯽種群遺傳結構的研究中，對成都平原近西北邊緣地區進行了較大力度的調查，新發現了金馬河(岷江都江堰以下干流)、邛崍水口鎮(南河支流紅巖河)、雅安市大興鎮、樂山市夾江縣和水口鎮等分布點。至此稀有鮈鯽的分布實際已涉及岷江中游、沱江上游、大渡河中下游和青衣江中下游，呈不連續的點狀分布。推測稀有鮈鯽在成都平原西部曾廣泛分布過，因農田水利等人類活動導致了其生境片段化[19]。

在所有已知的分布點中，模式產地即漢源縣九襄鎮流沙河河漫灘上其種群數量最多，其次是樂山市夾江縣，而其他分布點的種群數量都較小。此外，稀有鮈鯽在一些岔流河漫灘上也有分布，河底質基本是卵石覆蓋。野外采集地的常見理化參數見表1。

綜合模式種發現地及長期生境研究結果，稀有鮈鯽的典型生態環境是稻田、溝渠、河流及漫灘，且環境質量相對較高(溶解氧充沛、人為干擾較少)的自然及農耕環境。這在我國生態系統中有著一定程度的普遍性和共性。

2 稀有鮈鯽的生物學特點(Biological features of rare minnow)

2.1 基本形態特征

小型魚類，通常全長38～45 mm達到性成熟，已知最大個體全長85 mm。體紡錘形，稍側扁，胸、腹部圓，無腹棱，頭中等大。側線不完全，吻鈍，口較小、端位，無鼻須。下咽齒2行，齒式為2.4～4.2。背鰭無硬刺，鰭式為iii-7～8；胸鰭不達腹鰭，腹鰭不達臀鰭；臀鰭鰭式為iii-6～7，肛門緊靠臀鰭起點。尾鰭分叉，分枝鰭條17，上下葉幾乎等長。稀有鮈鯽體側具有淡黃色寬縱紋，腹部白色，尾鰭基中部有一較明顯的黑斑，在繁殖季節成魚體側金黃色縱帶鮮艷[9, 20]。在飼養條件下，稀有鮈鯽的體色會隨著水族箱的顏色和光照的強弱而變化[21]。一般成年雌魚腹部飽滿，雄魚輕壓腹部可擠出乳白色精液。雄魚胸鰭、腹鰭的相對長度較長，胸鰭末端距離腹鰭起點距離較近，鰓蓋、胸鰭上有細小的棘狀珠星；雌魚胸鰭、腹鰭的相對長度較短，一般體表光滑，無珠星[12]。

2.2 胚胎發育與胚后發育

稀有鮈鯽的胚胎發育過程與多數淡水硬骨魚類相似。卵受精后不久即在動物極形成胚盤并逐漸增高，卵裂局限在動物極所在半球，分裂球及囊胚的高度約占整個卵垂徑的1/3以上，以內卷和下包的方式形成原腸胚。在(25±1) ℃條件培育下，整個發育過程耗時約75 h，分為22個發育時期[22]。稀有鮈鯽孵化時器官分化程度較高，已發育至鰾雛形期。在(25±1)℃條件培育下，1日齡(dph)仔魚鰾充氣，2 dph仔魚具備平游模式并開始攝食，進入混合營養期。隨后，仔魚先后歷經卵黃囊吸盡、背鰭分化、臀鰭分化、鰾二室形成、腹鰭芽出現并形成、鱗片出現并形成等一系列發育事件逐步完成胚后發育，整個胚后發育階段歷時約25～30 d。溫度對稀有鮈鯽的胚胎發育和胚后發育均具有重要的影響，發育速率隨著溫度的上升而上升[20, 22,-23]。

2.3 攝食與生長

稀有鮈鯽在自然界中主要以昆蟲幼蟲、浮游生物、著生藻類、水蚯蚓等為食[20]。仔魚在24.7 ℃～31.8 ℃下，孵出后2 d的仔魚即可攝食，4 d卵黃吸盡[20]，持續饑餓或延遲初次投喂時間對仔魚的生長、發育、存活有深刻的影響，持續饑餓8～10 d達不可逆點[25]。在初次性成熟以前，稀有鮈鯽的長度生長較快，隨著日齡的增加與發育(90 d以后)，其生長速度逐漸減小[20- 23, 25]。除了餌料的營養條件[20]，養殖環境因子[23]、投喂頻次[24]和養殖密度[20, 21, 24]對稀有鮈鯽的生長也具有重要的影響。稀有鮈鯽生長效率較低，代謝耗能較多，雄魚生長速度及攝食率低于雌魚，一般情況下，雌魚食物能用于代謝的比例較雄魚低，而用于生長的比例較雄魚高[26]。

2.4 繁殖生物學特征

稀有鮈鯽的原始生殖細胞起源于內胚層，卵巢解剖學上的分化發生在孵化后的第21日齡左右，細胞學上的分化發生在35日齡(dph)左右；精巢的分化晚于卵巢，解剖學上的分化開始于50～60 dph之間，細胞學上的分化發生在60 dph左右[27]。稀有鮈鯽的卵為球形，產出后吸水膨脹，透明，具粘性，卵膜徑1.25～1.70 mm，比重大于水[22]。隨著胚胎發育，卵膜粘性減弱并逐漸消失[12]。稀有鮈鯽精子主要由頭部、中片和鞭毛3部分組成，頭部前端無頂體，被有質膜[28]。頭部長(1.246±0.083) μm，寬(1.053±0.172) μm，尾長約(37.21±2.536) μm；精子密度為(4.623±0.170)×109ind.·mL-1，精子生存的最適NaCl濃度和pH值分別為0.55%和8.0[28]。

表1 稀有鮈鯽野外生境常見理化參數值Table 1 Physical and chemical characteristics of rare minnow habitat

注：D表示大渡河流域，M表示岷江流域，Q表示青衣江流域，T表示沱江流域。

Note: D stand for Dadu River Basin; M stand for Min River Basin; Q stand for Qingyi River Basin; T stand for Tuo River Basin.

自然條件下，稀有鮈鯽的繁殖季節為3～11月[12]，在人工控制條件下可實現周年繁殖。一般為3～6 d產卵一次，產卵間隔眾數為4 d，屬于連續產卵型[12, 29]。120～150 d個體每次產卵平均可達100粒以上，1年齡以上的個體產卵量平均可達300粒以上[21]。稀有鮈鯽卵的受精率和孵化率均較高，均在75%以上[21]。對于已產多批的魚，產卵間隔時間長短和批產卵量大小與雌魚體長沒有顯著關系，而與水溫、餌料和個體生理狀況不同有關[21]。產卵間隔長，多發生在水溫較低或餌料不足時；批產卵量小則多發生在餌料不足或連續多次大量產卵之后[12]。此外，研究表明，餌料種類及其營養成分對稀有鮈鯽親魚的繁殖性能也具有重要的影響[24, 30]。稀有鮈鯽的產卵量和受精率均與體重存在顯著的正相關，但與性腺重無顯著相關[12, 21]。稀有鮈鯽對產卵條件要求很低，可在14.0 ℃～29.6 ℃下產卵繁殖[12]。在24 ℃～27 ℃條件下產卵規律性較強，高溫對繁殖有明顯抑制，對卵苗發育也有一定影響。綜合產卵和卵苗發育情況，稀有鮈鯽最適宜產卵溫度為25 ℃～26 ℃[23, 31]。

產卵活動一般在傍晚至午夜之間進行，雌魚在雄魚的追逐、觸碰和貼靠下發情產卵，產卵多發生在18:00—24:00，產卵可持續2～4 h。夏季產卵時間較晚，而初春、秋末(及冬季)產卵時間較早。在陰雨天氣也偶見中午、下午產卵[12]。最近的研究表明，在光照黑暗顛倒的條件下，稀有鮈鯽產卵活動也隨之改變，因此可通過控制光照周期進而控制產卵時間[31]。

2.5 遺傳學特征

稀有鮈鯽具有25對染色體，屬于典型的原始鯉科魚類染色體核型[32]。核型中No.1～No.9 為中著絲粒染色體；No.10～No.20為亞中著絲粒染色體；No.21～No.25為亞端部著絲粒染色體。核型組成為18 m + 22 sm + 10 st[32]。游翠紅等[33]利用雌核發育和人工性反轉技術對稀有鮈鯽性別決定可能的染色體類型進行初步探討，結果發現稀有鮈鯽性別決定既不是典型的XY型也不是ZW型，而可能與斑馬魚(Danio rerio)相似，擁有復雜的染色體性別決定機制。

童金茍等[34]通過測定了稀有鮈鯽體細胞DNA含量平均為(2.660±0.007) pg，推測基因組大小約為1.3 Gb。最近，中國科學院水生生物研究所已完成了稀有鮈鯽全基因測序工作，但尚未發表。從初步結果看，稀有鮈鯽的基因組大小約為1.08 Gb，基因組雜合度為0.5472，屬于雜合度較高的基因組。有理由相信，稀有鮈鯽全基因組發表后會極大地推動稀有鮈鯽在各領域的應用研究。

2.6 對環境因子的適應性和耐受性

3 稀有鮈鯽作為模式生物的優點(The advantage of rare minnow used as model organism)

(1)生活史周期短

與OECD[38]推薦使用的斑馬魚、黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)、青鳉(Oryzias latipes)等常用模式魚類相似，稀有鮈鯽性成熟較快，部分個體孵化后3個月性成熟，4個月即可產卵繁殖[39]。人工飼養條件下，一年可培育3代。這一特點使得魚類繁殖試驗、兩代毒性試驗等與傳代有關的實驗研究變得快捷。

(2)連續產卵，繁殖性能優越

在水溫適宜以及餌料充沛的條件下，室內養殖稀有鮈鯽可周年繁殖，同一對魚每隔3～4 d產卵一次，產卵規律性很強，且產卵量較大。多年養殖發現，4～5月齡的稀有鮈鯽的產卵量在幾十粒到幾百粒之間，平均產卵量110～130 粒[21]。1齡多的稀有鮈鯽產卵量有所增加，平均產卵量可達300多粒[12, 21]。稀有鮈鯽的批產卵量(繁殖量)與斑馬魚、黑頭軟口鰷和唐魚等相當，顯著大于青鳉和劍尾魚。

(3)卵具粘性，卵膜透明，卵膜徑較大

稀有鮈鯽產粘性卵，卵粒遇水后略為膨脹，飽滿且富有彈性[22]。隨著孵化的進行，卵膜的粘性逐漸減弱。卵膜的粘性可使胚胎得以固定，進而方便觀察。最新的研究表明，稀有鮈鯽卵的粘性也可以通過次氯酸鈉浸泡進行消除，進而方便胚胎轉移(蘇良霞，未發表)。稀有鮈鯽的卵外觀無極性，接近正圓形，卵膜徑1.25～1.70 mm之間[22]，卵膜徑的大小與水體的硬度(或離子濃度)有很大的關系[40]。稀有鮈鯽的卵膜徑與黑頭軟口鰷相當，但顯著大于斑馬魚、青鳉、唐魚等模式魚類(表2)，這在一定程度上有利于實驗操作者觀察。此外，稀有鮈鯽卵膜透明，相比于青鳉更容易看清胚體發育進展和活動狀況，而稀有鮈鯽胚體體表的色素細胞顯著少于斑馬魚，相比于斑馬魚更容易看清胚胎的形態異常特征。

(4)個體較小，飼養方便

稀有鮈鯽不僅性成熟早，而且成魚個體大小也較小，適合在小型水族箱中進行飼養，便于在室內進行批量養殖與實驗，節省空間和經費。稀有鮈鯽可飼養在普通玻璃水族箱或其他類似容器內，靜水、流水、循環水均適宜。根據多年的養殖經驗，20 L的水族箱適合于稀有鮈鯽產卵繁殖，該大小的水族箱也適合于飼養仔魚和幼魚。稀有鮈鯽產卵繁殖并不必須流水刺激，也不需水草或其他產卵基質[12]。

稀有鮈鯽食性較廣，可攝食昆蟲幼蟲、浮游生物、著生藻類、水蚯蚓[41]。由于稀有鮈鯽初孵仔魚顯著大于斑馬魚、唐魚，初次攝食時并不需要投喂草履蟲、蛋黃等，而可直接用豐年蟲無節幼體作為開口餌料，其后可逐步投喂經過消毒處理的水蚯蚓、搖蚊幼蟲等生物餌料，也可投喂人工配合飼料。最近的研究還表明，在不同溫度、投喂頻率、投喂量的情況下，稀有鮈鯽可通過調節腸道排空速率等生理變化適應不同的投喂策略[24]。

(5)溫度耐受范圍廣

稀有鮈鯽是一種廣溫性魚類，能適應0 ℃～36 ℃的養殖水溫[35]，其溫度耐受范圍大于黑頭軟口鰷、劍尾魚、唐魚等模式魚類，對低溫的耐受能力也顯著大于斑馬魚(表2)。稀有鮈鯽胚胎可在平均水溫13.0 ℃～31.6 ℃范圍內完成正常的發育[22]，親魚則可在14 ℃～30 ℃下完成產卵活動[12]。此外，稀有鮈鯽胚胎對于溫度驟變的耐受性也比較強，可耐受23 ℃→35 ℃→23 ℃的溫度變化[36]。在實驗過程中，可以通過低溫對胚胎發育的遲緩作用來延長稀有鮈鯽的發育時間，進而實現對實驗進程的控制[22]。

(6)耐低氧能力強

稀有鮈鯽具有較強耐低氧能力，對水體中CO2耐受性強[37]。根據陳寧生和施瑔芳[42]的研究，家魚在CO2濃度為80 mg·L-1時出現呼吸困難的現象，而稀有鮈鯽在130～150 mg·L-1時才出現類似的現象，顯然稀有鮈鯽的耐受高CO2的能力較強[37]。通常認為熱帶魚類屬于需氧量較低的魚類[43]，而稀有鮈鯽的窒息點為0.398～0.646 mg·L-1[37]，與熱帶模式魚類劍尾魚相當，這說明稀有鮈鯽具有較強的耐低氧能力。

(7)硬度耐受范圍廣

盡管稀有鮈鯽是我國長江上游特有的一個地方種，其分布區零星地散布于我國西南地區的岷江流域、沱江流域、青衣江流域和大渡河流域，但其對水體總硬度、鈣鎂比例以及電導率的適應范圍很廣。稀有鮈鯽可在水體總硬度小于480 mg·L-1CaCO3的水體中完成受精，胚胎則可以在水體總硬度為0～960 mg·L-1CaCO3(水體電導率為100～2 000 μS·cm-1)的水體中正常地孵化和生長發育；胚胎可在鈣鎂比例為1:20～8:1的水體中正常地孵化和生長發育[31]。由于我國的城鎮飲用水水體總硬度標準為小于450 mg· L-1CaCO3，同時各大城市的飲用水鈣鎂比例為3:2～7:1，因此我國大部分地區的自來水經曝氣后均可作為飼養稀有鮈鯽的水源。

(8)分類學、生態學代表性

鯉科是現生魚類中最大的一個科，約有3 000余種[44]，也是我國淡水魚類中最大的一個科[45]。據統計，我國分布有鯉科魚類664種，是我國各大水系魚類區系的重要組成部[45]。如黑龍江流域有淡水魚類99種，其中鯉科魚類56種，占56.6%[46]；長江流域純淡水魚類378種，鯉科魚類190種，占50.26%[47]；珠江流域純淡水魚類357種，其中鯉科魚類205種[46]。稀有鮈鯽隸屬于鯉科，從形態學特征和系統發育位置看，屬于鯉科雅羅魚系鮈亞科[16-18]。鮈亞科是鯉科12個亞科中種類最多的亞科之一，分布于亞歐兩洲，廣布于東亞水域，是我國江河魚類的重要組成部分。在長期的演化和發展中，鮈亞科魚類在形態、生態上特化出一系列特征，適應江河平原區水文、地理、氣候、生境。作為鯉科魚類的代表和喜流水生活魚類的代表，對稀有鮈鯽的研究有助于揭示鯉科魚類基本的生命過程和規律，同時稀有鮈鯽對污染等環境變化的響應也代表了我國多數淡水魚類一般情況。

我國地域遼闊，南北跨越緯度50°左右，跨不同的溫度帶。生活在各水域的淡水魚類，在溫度適應性上也有冷水性魚類、溫水性魚類、暖水性魚類等類型。稀有鮈鯽是一種溫水性魚類，同時也是溫度適應范圍很廣的廣溫性魚類，從溫度適應性來看，其可以作為我國大部分內陸水域魚類的代表。

魚類是水生生態系統中的消費者，其中大部分魚類為溫和肉食性魚類，主要以無脊椎動物為食。從營養等級來看，像稀有鮈鯽這樣的溫和肉食性魚類是我國淡水魚類的主體，其中有部分魚類還兼食碎屑等，被稱為雜食性魚類，而植食性魚類、兇猛肉食性魚類的種類不多。因此，從水生生態系統的營養級來看，稀有鮈鯽代表了水體中的次級消費者，也代表了魚類種類數最多的營養級。

(9)具有較好的研究基礎

作為一種模式生物，清楚的基礎生物學背景與充足的研究工作基礎是必備的條件。自1990年開始進行實驗動物化研究以來，稀有鮈鯽已有較多的基礎資料積累與應用。據不完全統計，截至2015年底，有關稀有鮈鯽的研究論文已有258篇，其中中文核心期刊149篇，SCI 107篇，主要涉及稀有鮈鯽基礎生物學、病理學、遺傳學、毒理學等領域。

稀有鮈鯽應用最多的是毒理學領域，且呈逐年上升的趨勢(圖1)。由于稀有鮈鯽對鉻(Cr6+)、銅(Cu2+)、鋅(Zn2+)和五氯酚(PCP)的毒性測試結果重復性較好，稀有鮈鯽對于這些參比毒物的敏感性不亞于黑頭軟口鰷、虹鱒、藍鰓魚、斑馬魚等常用實驗魚類[48]。盧玲等[49]發現稀有鮈鯽和劍尾魚對化學品和環境水樣的敏感性無顯著性差異，二者均是理想的毒性試驗材料。稀有鮈鯽對水中三丁基錫具有顯著的生物富集作用，是一種靈敏的試驗材料[50]。稀有鮈鯽對雌激素類物質具有較高的敏感性，具備成為污染監測的模型動物的潛質[51]。稀有鮈鯽的卵黃蛋白原對17-乙炔基雌二醇暴露的敏感性要比斑馬魚更為敏感[52]。姜福全[53]研究發現稀有鮈鯽對鉻的敏感性雖略低于斑馬魚和劍尾魚，但稀有鮈鯽對五氯酚的敏感性明顯較高。稀有鮈鯽對炔雌醇的敏感性要大于青鳉，而與斑馬魚相當，稀有鮈鯽短期繁殖試驗是一種可行的毒性測試方法[54]。事實上，稀有鮈鯽不僅是一個優良的急性毒性測試物種，還是一種較好的亞慢性試驗材料[48, 55]。這在東湖底泥[56]和氮污染物[57]的毒性測試中都得到了驗證。此外，鐘雪萍[58]研究發現，稀有鮈鯽是一種評價類雌激素毒性效應的理想活體實驗模型。

隨著我國對化學品環境管理制度的建立，稀有鮈鯽逐漸批量地應用于化學品生態毒理學測試中。2003年，《化學品測試方法》[59]將稀有鮈鯽作為推薦的受試魚類之一。2003年9月原國家環境保護總局發布《新化學物質環境管理辦法》[60]后，我國相繼制訂了一系列化學品測試的國家標準，在與魚類測試相關的標準中，稀有鮈鯽均被作為受試魚類。2010年，新化學物質環境管理辦法修訂后，稀有鮈鯽作為被推薦受試魚種中唯一的本土類得到了更多的應用。2013年，國家標準“化學品稀有鮈鯽急性毒性試驗”頒布實施，標志著稀有鮈鯽已開始成為我國化學品測試中主要使用的本土魚類。據不完全統計，2012年以來僅中國科學院水生生物研究所就向各測試機構提供測試用魚6萬余尾，極大地推進了稀有鮈鯽作為化學品測試用魚的應用。

4 稀有鮈鯽實驗動物標準化研究概況(General introduction to standardization of rare minnow as laboratory animal)

實驗動物是指經人工飼育，對其攜帶的微生物及寄生蟲實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的用于科學研究、教學、生產、檢定以及其他科學實驗的動物[61]。模式生物則是用于研究和展現普遍規律的實驗動物。根據國家《實驗動物管理條例》[62]以及相關的法規，我國實驗動物的管理主要采取基于標準和質量檢測的許可認證制度。實驗動物要求在微生物學、寄生蟲學、遺傳學、營養學、飼養環境等方面實現標準化。經過20多年的努力，稀有鮈鯽已基本實現了實驗動物標準化，特別是在國家科技支撐項目的資助下，已完成了《實驗稀有鮈鯽第1部分：微生物學等級與監測》、《實驗稀有鮈鯽第2部分：寄生蟲學等級標準》、《實驗稀有鮈鯽第3部分：遺傳質量控制標準》、《實驗稀有鮈鯽第4部分：病理診斷標準》、《實驗稀有鮈鯽第5部分：營養與飼料標準》、《實驗稀有鮈鯽第6部分：飼養環境與設施標準》等標準研究稿以及相關的技術規范?！秾嶒瀯游锕芾砼c使用指南》中匯集了這些標準和規范的主要內容[63]，以下對標準的關鍵控制內容作一簡要介紹。

圖1 稀有鮈鯽相關論文發表情況統計Fig. 1 Statistics of published papers in rare minnow

4.1 寄生蟲學和微生物學標準化

主要參照了GB14922[64]關于實驗動物微生物學分類的定義，將實驗稀有鮈鯽分為普通級Conventional (CV) rare minnow、清潔級Clean (CL) rare minnow和無特定病原體級Specific pathogen free(SPF) rare minnow。普通級控制4種微生物、6種寄生蟲，清潔級需增加控制5種微生物和4種寄生蟲。由于嗜水氣單胞菌實際很難排除，而且并不是所有嗜水氣單胞菌均具有致病性，標準研究稿特別指出只針對致病性氣單胞菌進行控制。需要強調的是，上述病原體是針對稀有鮈鯽的病原體，而不是針對哺乳動物和人類，因此實際控制這些病原所需的環境等方面的支撐條件并不像傳統實驗動物那么高。同時由于目前尚沒有無菌稀有鮈鯽，也沒有其批量的需求，因此暫未設定無菌級。清潔級實際是我國根據需要設定的過渡級別，與SPF級差別并不大，因此在稀有鮈鯽標準頒布及動物培育時可直接按SPF級進行控制。

4.2 遺傳質量標準化

實驗稀有鮈鯽遺傳學分類包括近交系(inbred strain)、封閉群(closed colony)和雜交群(hybrids)。目前稀有鮈鯽已有的遺傳資源包括1個近交系和1個封閉群。HAN系是由1990年采自四川省漢源縣的1對個體通過全兄妹交配方式培育的近交系，目前已傳至第33代，具有較高的遺傳純合度[65-67]。由于近交系繁殖性能較低，作為稀有鮈鯽第一個野生型近交系，目前只是保種維持，以備將來遺傳改造等用途，未批量應用于科研和檢測中。IHB系是由2006年采集于四川省漢源縣的50對個體按照最佳避免近交法繁育的封閉群。由中國科學院水生生物研究所保持的Ihb:IHB，目前已傳至10代。遺傳質量監測結果表明，該品系具有較高的遺傳多樣性[68-69]，且對化學品敏感，可作為化學品生態毒理學測試的種源[70]。由于IHB系既保持了群體的遺傳穩定性，又保持動物個體的雜合性，避免了近交衰退，其生活力、生育力都比近交系強，適合于大量生產，目前國內科研和檢測中所用的稀有鮈鯽大部分是IHB系或引種后自行繁育的后代。

實驗稀有鮈鯽遺傳質量檢測方法主要包括形態特征檢測和以微衛星標記為主的分子遺傳質量檢測[18,67]。其中封閉群遺傳質量監測的主要控制指標為雜合度0.5～0.7，且群體達到哈溫平衡，這就要求各用魚單位注意封閉群的保種繁育方式，若發現雜合度下降、近交系數上升過快，應重新引種。由于魚類體外受精、體外發育，這使得采用現代遺傳學技術快速培育品系較為方便，因此可以通過單性發育、核移植(克隆)等技術手段快速建立稀有鮈鯽近交系。

4.3 營養與飼料標準

與其他實驗動物的營養學標準相比，實驗稀有鮈鯽的標準有2個特點。一是規范了生物飼料的使用。雖然理論上以及小規模實驗中，用人工飼料培育各個生活史階段的稀有鮈鯽均可行，但實際應用中因無專用高質量的飼料生產，且人工飼料喂養后對水環境管理的壓力較大，因此飼養和實驗中很難避免采用生物飼料喂養稀有鮈鯽。生物飼料指經過人工篩選的、可進行人工培養且適合稀有鮈鯽采食的飼料生物。適用于實驗稀有鮈鯽的生物飼料包括輪蟲(Rotifer)、豐年蟲(Artemia spp.)、枝角類(Cladoceran)、橈足類(Copepoda)、水蚯蚓(Limnodrilus spp.)、搖蚊幼蟲(Chironomidae larvae)等，可以投喂普通級的實驗稀有鮈鯽。而對于清潔級、SPF級稀有鮈鯽，由于基本要求是經過滅菌處理，因此實際能使用的生物飼料主要是潔凈環境中孵化的豐年蟲無節幼體。二是根據稀有鮈鯽不同的生活史階段，分別在餌料類別、營養、顆粒大小等方面進行控制。如2～7日齡的仔魚需投喂豐年蟲無節幼體或者經120目過篩的顆粒飼料；8～30日齡的稀有鮈鯽除投喂豐年蟲無節幼體外，可投喂100～120目的顆粒飼料；30日齡以上個體則主要投喂30～75目的顆粒飼料或者其他生物飼料。此外，實驗用稀有鮈鯽營養學與飼料標準還對人工配合飼料的營養水平、技術要求、檢驗方法、檢驗規則、標簽、包裝、運輸和貯存等進行了規范。

4.4 飼養環境與設施標準

稀有鮈鯽是水生動物，其環境條件控制實際包括室內環境和水環境。由于稀有鮈鯽被大量應用于毒理學研究和檢測中，該領域的研究現狀是主要使用普通級的稀有鮈鯽，而且今后相當長一段時間稀有鮈鯽的主要應用可能也是普通級的動物，因此在對普通級的室內環境和水環境進行規范時充分考慮了國內大部分實驗室的現狀；而對于清潔級或SPF級的動物，則根據實際需要提出了需要增加控制的基本要求。

在室內環境要求方面，除設施建筑的一般要求外，普通級稀有鮈鯽只在室溫(14～30 ℃)、噪聲、光照等方面進行了規范；而清潔級或SPF級則主要參照《GB 14925—2010 實驗動物環境與設施》[71]和《GB 50447—2008 實驗動物設施建筑技術規范》[72]有關的要求，按空氣潔凈度7～8級控制。

在水環境控制方面，首先對水源進行了規范，即需滿足《GB 5749—2006 生活飲用水衛生標準》[73]中常規指標的要求，即排除了重金屬、農藥等污染的可能性。養殖用水既可以是脫氯自來水也可以是符合要求的再造水，但需要在水溫、硬度、電導、pH、溶解氧、氨氮、非離子氨、亞硝酸鹽、硝酸鹽等方面進行控制，這些指標在飼養過程中是可能發生變化的，因此也對監測頻率進行了規范。普通環境與潔凈環境中的水質指標是相近的，只是潔凈環境中對溫度、電導和溶氧的控制要求稍高。實驗用稀有鮈鯽飼養環境與設施標準還對養殖缸與用具、養殖密度、廢棄物及動物尸體處理、實驗魚運輸等進行了規范。

5 結語(Conclusion)

稀有鮈鯽在我國已有20年多年的系統研究，數以百計的研究文獻覆蓋了遺傳學、基礎生物學、毒理學、病理學等關鍵標定模式生物的學科領域。在遺傳標記、生物形態標記、飼養環境及微生物控制等關鍵領域的研究均達到了國際上生態毒性研究模式生物的基本要求。

稀有鮈鯽作為鯉科魚類，是我國水生生態系統中具有代表性的魚種，其自然分布的生境環境質量良好、少污染，代表我國溪流、溝渠等小水體的健康狀態。在我國20年來的環境毒理學研究實踐中，其繁殖周期短、卵透明、對多種化學品敏感且試驗重復性好等普適性受試生物特征得到了充分體現。因此，在化學品測試領域，稀有鮈鯽作為我國代表性的本土模式生物，具有廣泛的應用前景。

致謝：中國科學院水生生物研究所唐瓊英、羅思、蘇良霞、邱寧等同志收集整理有關資料，上海市檢測中心殷浩文、中國水產科學研究院長江水產研究所何勇鳳同志提出寶貴意見，一并致謝。

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Gobiocyprisrarusas a Chinese Native Model Organism: History and Current Situation

Wang Jianwei*，Cao Wenxuan#

Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China

26 November 2016 accepted 17 January 2017

Rare minnow, Gobiocypris rarus is a small cyprinid fish endemic to China. From the beginning of 1990, researchers in the Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, did a series of studies on this fish for the purpose of establishment of a new laboratory animal and to promote its application in various research fields. With the establishment of rules and regulations on environmental management of chemicals in China, rare minnow has gradually become the most important test fish species. In this paper, biological characteristics of this fish were reviewed, including systematic position, geographical distribution, habitat, morphological characteristics, ontogenesis, growth, reproduction, genetic features, and adaptability to environment. The merits of rare minnow as model organism were summarized. In addition, a brief introduction on standardization of experimental rare minnow was given. Along with the advance of works on laboratory animal standardization and genome sequencing, rare minnow will be more widely used as a representative model organism with Chinese characteristics.

Gobiocypris rarus; model organism; biological characteristic; laboratory animal standardization

國家科技支撐計劃(2011BAI15B01-41)；湖北省科技支撐計劃(2015BCE098)

王劍偉(1967-)，男，研究員，博士，研究方向為魚類生態學和實驗動物，E-mail: wangjw@ihb.ac.cn

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: wxcao@ihb.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20161126001

2016-11-26 錄用日期：2017-01-17

1673-5897(2017)2-020-14

X171.5

A

王劍偉(1967—)，男，研究員，主要從事魚類生態學和實驗動物學研究。

共同通訊作者簡介：曹文宣(1934—)，男，研究員，中國科學院院士，主要從事魚類學研究。

王劍偉,曹文宣. 中國本土魚類模式生物稀有鮈鯽研究應用的歷史與現狀[J]. 生態毒理學報，2017, 12(2): 20-33

Wang J W, Cao W X. Gobiocypris rarus as a Chinese native model organism: History and current situation [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 20-33 (in Chinese)