離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑?qū)ρ笫[的遺傳毒性作用

包小丹，李天函，郭夢龍，楊威利，李耀華，王文鋒，井長勤

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003

離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑?qū)ρ笫[的遺傳毒性作用

包小丹，李天函，郭夢龍，楊威利，李耀華，王文鋒，井長勤*

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003

為探討咪唑類離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][C1])對洋蔥的遺傳毒性，用濃度分別為2.5、5、10和20 mmol·L-1的[C8mim][C1]處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞和洋蔥根尖8 h，用濃度為10 mmol·L-1的[C8mim][C1]處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞和洋蔥根尖4 h、8 h、12 h和24 h，研究[C8mim][C1]對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核的影響和對洋蔥根尖有絲分裂指數(shù)和染色體畸變的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著[C8mim][Cl]處理濃度和時間的增加，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核偏移率明顯升高，根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)顯著降低，染色體畸變現(xiàn)象明顯，畸變率升高。研究表明，當(dāng)濃度達(dá)到 2.5 mmol·L-1時，[C8mim][Cl]對洋蔥具有遺傳毒性。

[C8mim][Cl]；洋蔥；遺傳毒性

離子液體(ionic liquids, ILs)具有許多優(yōu)良的特性，如不揮發(fā)、高熱穩(wěn)定性、不易燃等[1-2]，被作為一類新型的環(huán)境友好型“綠色溶劑”，故它在化學(xué)合成、精細(xì)化學(xué)加工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并顯示出了非常好的效果和應(yīng)用前景[3]。但是，離子液體在生產(chǎn)和使用過程中，可能會流失到環(huán)境中引起環(huán)境污染[4]，在生物體中進(jìn)行富集且不易降解[5]，對生物體產(chǎn)生嚴(yán)重危害。因此有必要對離子液體的毒性進(jìn)行評估，現(xiàn)在有很多學(xué)者研究了離子液體對某些動物、植物、微生物的影響[6-8]。離子液體種類很多，對不同生物體的毒性差異比較大，需對其毒性做進(jìn)一步研究，為全面評估離子液體的毒性提供更多依據(jù)。咪唑類離子液體是最常見、使用最廣泛的一類離子液體，本實驗選用氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][Cl])為代表研究離子液體的毒性。洋蔥廉價、易于在室內(nèi)培養(yǎng)，是觀察細(xì)胞核和有絲分裂的較佳材料。洋蔥根尖實驗是國際上常用的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性檢測方法，具有靈敏、簡便、快速的特點。因此，本實驗研究了[C8mim][Cl]對洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的影響、對洋蔥根尖細(xì)胞分裂和洋蔥染色體畸變的影響，通過研究[C8mim][Cl]對洋蔥的遺傳毒性，探討[C8mim][Cl]對生物體的毒性，為全面評估離子液體的毒性提供更多依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

紅皮洋蔥(Allium cepa)，購自新鄉(xiāng)市農(nóng)貿(mào)市場；[C8mim][Cl]，純度為99.5%，購自湖北恒碩化工有限公司，用純凈水配成1 mol·L-1的母液。

1.2 預(yù)處理

挑選完整無損、大小均勻的新鮮洋蔥5顆，撕掉外表皮，去除老根，在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時使其活化。

1.3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核的作用

切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，放入不同濃度(2.5、5、10和20 mmol·L-1)[C8mim][Cl]中處理8 h，對照組使用自來水。處理結(jié)束后用改良苯酚品紅染液染色做常規(guī)制片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核形態(tài)和位置變化，每張片子選取5～10個視野，觀察1 000個細(xì)胞，計算細(xì)胞核偏移率。細(xì)胞核偏移率等于細(xì)胞核邊緣化細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核的作用

切取1 cm2左右的洋蔥內(nèi)表皮若干，放入10 mmol·L-1[C8mim][Cl]中處理，在4 h、8 h、12 h和24 h時取樣，用改良苯酚品紅染液染色做常規(guī)制片、觀察、照相，計算細(xì)胞核偏移率。

1.5 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

取正常生長的根長為2 cm的洋蔥，移入不同濃度(2.5、5、10和20 mmol·L-1)[C8mim][Cl]中處理8 h，對照組使用自來水。處理結(jié)束后恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h，剪取根尖，卡諾液固定24 h，保存于4 ℃、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中。染色、壓片，在顯微鏡下觀察洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂狀況。分裂細(xì)胞包括前期、中期、后期、末期的所有細(xì)胞，統(tǒng)計1 000個左右細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)，計算有絲分裂指數(shù)。有絲分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)(%)[9]。

1.6 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

取正常生長的根長為2 cm的洋蔥，移入盛有10 mmol·L-1[C8mim][Cl]的小燒杯中，在處理4 h、8 h、12 h和24 h時取樣，恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h。剪取根尖，卡諾液固定24 h，保存于4 ℃、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中。染色、壓片，在顯微鏡下觀察洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂狀況，計算有絲分裂指數(shù)。

1.7 [C8mim][Cl]處理后對染色體畸變的影響

計算根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)后，觀察染色體畸變情況；我們只統(tǒng)計中期、后期和末期的染色體畸變數(shù)，每處理組統(tǒng)計約300個分裂相，計算染色體畸變率。染色體畸變率=染色體畸變數(shù)/分析的染色體總數(shù)(‰)[9]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核的作用

未經(jīng)[C8mim][Cl]處理的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核形態(tài)正常，著色較深，位于細(xì)胞中央，位置未發(fā)生偏移；經(jīng)過[C8mim][Cl]處理8 h后，細(xì)胞核形態(tài)逐漸發(fā)生變異，并且隨著濃度的增加，細(xì)胞核發(fā)生腫脹，著色變淺，核偏移現(xiàn)象嚴(yán)重。對照組細(xì)胞核偏移率為6.5%，2.5、5、10和20 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞8 h后，細(xì)胞核偏移率依次為21.5%、25%、27%和35%，與對照組相比差異性顯著(P<0.05)(圖1)。

2.2 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核的作用

[C8mim][Cl]處理時間對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核偏移的影響存在差異，隨著[C8mim][Cl]處理時間的延長，細(xì)胞核逐漸變大，著色變淺，核偏移現(xiàn)象加重。10 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理4 h、8 h、12 h和24 h后細(xì)胞核偏移率依次為19%、27%、32%和53%，各處理組相比差異性顯著(P<0.05)(圖2)。

2.3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

[C8mim][Cl]造成了洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的降低，對照組根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)為16.4%，2.5、5、10和20 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖8 h后，有絲分裂指數(shù)依次為15.1%、13.9%、10.9%和4.6%，隨濃度的增加，有絲分裂指數(shù)逐漸降低，與對照組相比，各濃度處理組有絲分裂指數(shù)均具有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

圖1 不同濃度[C8mim][Cl]對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核偏移的影響注：A 顯微鏡下的圖像，其中a，0 mmol·L-1；b，2.5 mmol·L-1；c，5 mmol·L-1；d，10 mmol·L-1；e，20 mmol·L-1。B 細(xì)胞核偏移的量化分析，與對照相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，下同。Fig. 1 Effects of [C8mim][Cl] at different concentrations on nuclear morphological change of onion endothelial cellsNote: A. Onion endothelial cells imaged by microscope; a, 0 mmol·L-1; b, 2.5 mmol·L-1; c, 5 mmol·L-1; d, 10 mmol·L-1; e, 20 mmol·L-1. B. Quantitative analysis of nuclear morphological change of onion endothelial cells; asterisk denotes a response that is significantly different from the control (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). The same below.

圖2 [C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核偏移的影響注：A 顯微鏡下的圖像，其中a，4 h；b，8 h；c，12 h；d，24 h。B 細(xì)胞核偏移的量化分析。Fig. 2 Effects of [C8mim][Cl] on nuclear morphological change of onion endothelial cells for different treatment timeNote: A. Onion endothelial cells imaged by microscope; a, 4 h; b, 8 h; c, 12 h; d, 24 h. B. Quantitative analysis of nuclear morphological change of onion endothelial cells.

2.4 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

[C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥根尖有絲分裂指數(shù)具有明顯的影響，處理4 h、8 h、12 h和24 h后，有絲分裂指數(shù)依次為15.3%、12.6%、8.5%和4.1%，隨著處理時間的增長，有絲分裂指數(shù)逐漸降低，與對照組相比，各時間處理組有絲分裂指數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

2.5 [C8mim][Cl]對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂過程中染色體畸變的影響

[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖細(xì)胞后，造成了多種染色體畸變現(xiàn)象的發(fā)生。洋蔥根尖經(jīng)過[C8mim][Cl]處理后，均有不同類型的染色體畸變，如染色體粘連、染色體橋、斷片、缺失、分配不均、染色體排列紊亂等，其中出現(xiàn)較為頻繁的是染色體粘連及染色體橋(圖5)。隨[C8mim][Cl]處理濃度及時間的增加，染色體畸變率總體呈升高趨勢，但是當(dāng)處理濃度在10～20 mmol·L-1、處理時間在12～24 h范圍時，染色體畸變率開始下降(圖5)。

圖3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響Fig. 3 Effects of [C8mim][Cl] at different concentrations on mitotic index of onion root tip cells

圖4 [C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥根尖有絲分裂指數(shù)的影響Fig. 4 Effects of [C8mim][Cl] on mitotic index of onion root tip cells for different treatment time

3 討論(Discussion)

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性對細(xì)胞的物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞起著重要的作用。[C8mim][Cl]既具有脂溶性，又具有水溶性，因此比較容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，作用于細(xì)胞器，影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA或其他物質(zhì)的代謝，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，[C8mim][Cl]處理洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞后，可引起其細(xì)胞核形態(tài)和位置發(fā)生變異，說明[C8mim][Cl]對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞造成了毒害作用，并且這種毒害作用隨著[C8mim][Cl]的濃度和處理時間的增加而加重。細(xì)胞核是細(xì)胞內(nèi)較大的細(xì)胞器，正常的細(xì)胞核能夠存在于細(xì)胞的一定位置，是由于細(xì)胞骨架的支撐作用。細(xì)胞核位置偏移細(xì)胞的中心，可能是因為當(dāng)細(xì)胞處于離子液體的環(huán)境中，離子液體能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，直接或間接作用于細(xì)胞骨架組裝或去組裝的相關(guān)蛋白，引起了細(xì)胞骨架的改變，從而改變了細(xì)胞核的位置，當(dāng)離子液體的濃度達(dá)到一定程度時，細(xì)胞骨架受損嚴(yán)重，細(xì)胞核缺少支撐作用，緊貼細(xì)胞膜分布。

研究表明環(huán)境中的有毒化學(xué)物質(zhì)如鉛和硒等能夠降低植物的有絲分裂指數(shù)，其機(jī)理是通過阻礙與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞周期的運行受到抑制，最終導(dǎo)致有絲分裂指數(shù)降低。本實驗結(jié)果表明，隨著[C8mim][Cl]處理濃度及時間的增加，洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)呈降低趨勢。[C8mim][Cl]濃度越大，處理時間越長，其在植物體內(nèi)的積累就越多，胞內(nèi)分裂相關(guān)蛋白的合成受阻就越明顯，有絲分裂指數(shù)越低。同時，[C8mim][Cl]能夠促進(jìn)活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)等的產(chǎn)生，抑制抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等的活性，進(jìn)而損害DNA，影響脂質(zhì)及相關(guān)蛋白質(zhì)的合成[11-12]，影響有絲分裂的正常進(jìn)行，使得有絲分裂指數(shù)降低。

當(dāng)生物體處于不良環(huán)境中時，會引起細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，形成染色體斷片、粘連或造成染色體排列紊亂、滯后的現(xiàn)象[13]。研究表明離子液體對水稻、石莼、蠶豆等植物有毒性作用，抑制其生長，造成DNA損傷等[14-17]。本實驗中，[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖細(xì)胞后，可以引起染色體橋、染色體粘連、缺失等畸變現(xiàn)象的發(fā)生。其發(fā)生的機(jī)制可能是通過以下3種途徑，一是[C8mim][Cl]進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，將DNA作為靶點，直接損害遺傳物質(zhì)，當(dāng)DNA的損傷程度超過DNA的修復(fù)能力時，則出現(xiàn)染色體畸變；二是損害與有絲分裂相關(guān)的分裂器如紡錘絲，干擾蛋白質(zhì)合成或RNA的轉(zhuǎn)錄，不能形成與染色體運動有關(guān)的物質(zhì)，間接引起有絲分裂異常，導(dǎo)致染色體畸變；三是通過干擾某些損傷的正常修復(fù)過程，阻止染色體在正常情況下的重建，而形成新的重排，出現(xiàn)染色體橋、粘連、斷片等現(xiàn)象。當(dāng)[C8mim][Cl]的濃度超過10 mmol·L-1、處理時間超過12 h時，染色體畸變率開始下降，可能是因為當(dāng)處理濃度及時間達(dá)到一定范圍時，離子液體能夠阻礙紡錘絲微管蛋白的聚合作用，致使細(xì)胞停留在分裂期。

圖5 [C8mim][Cl]對洋蔥根尖細(xì)胞染色體畸變的影響 注：A 顯微鏡下的圖像，下圖為上圖的局部放大圖，其中a，染色體落后；b，染色體粘連；c，染色體排列紊亂、缺失；d，染色體橋；e，染色體斷片(紅色箭頭所指)。B 洋蔥根尖細(xì)胞染色體畸變量化分析。Fig. 5 Effects of [C8mim][Cl] on chromosome aberration of onion root tip cells Note: A. Onion root tip cells imaged by microscope; arrow indicates a, chromosome lagging; b, chromosome adhesion; c, chromosome disorder and deletion; d, chromosome bridge; e, chromosome fragments. B. Quantitative analysis of chromosome aberration.

總之，當(dāng)濃度達(dá)到 2.5 mmol·L-1時，[C8mim][Cl]對洋蔥具有遺傳毒性，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核偏移、有絲分裂異常、染色體畸變等。

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◆

Genotoxic Effects of Ionic Liquid Chloride 1-Octyl-3-methylimidazolium on Onions

Bao Xiaodan, Li Tianhan, Guo Menglong, Yang Weili, Li Yaohua, Wang Wenfeng, Jing Changqin*

College of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China

14 June 2016 accepted 28 August 2016

The aim of this study was to explore the genotoxicity of imidazole ionic liquid chloride 1-octyl-3-methylimidazolium ([C8mim][C1]). Endothelial cells (EC) and root tip cells (RTC) of onion were treated with [C8mim][C1] at the variable concentrations for 8 hours (2.5, 5, 10 and 20 mmol·L-1). Cells were also treated with [C8mim][C1] at the concentration of 10 mmol·L-1for different time period of 4, 8, 12 and 24 hours, respectively. The effect of [C8mim][C1] on onion nucleus was observed, mitotic index was calculated and chromosome aberration of RTC were detected after the treatment of [C8mim][C1]. The results showed that [C8mim][Cl] exposure induced the location change of onion epidermal cell nucleus. In addition, [C8mim][Cl] caused the decrease of mitotic index of RTC and the increase of chromosome aberration ratio. These results demonstrated that the genotoxicity of [C8mim][Cl] on EC and RTC is in a dose- and time-dependent manner when the [C8mim][Cl] concentration reaches 2.5 mmol·L-1.

[C8mim][Cl]; onion; genotoxicity

河南省科技攻關(guān)項目(142102310045；152102210126)

包小丹(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為植物生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: 1057735318@qq.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jingchangqin@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160614001

2016-06-14 錄用日期：2016-08-28

1673-5897(2017)2-102-06

X171.5

A

井長勤(1972-)，男，理學(xué)博士，副教授，主要研究方向為細(xì)胞和分子毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。

包小丹, 李天函, 郭夢龍, 等. 離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑?qū)ρ笫[的遺傳毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 102-107

Bao X D, Li T H, Guo M L, et al. Genotoxic effects of ionic liquid chloride 1-octyl-3-methylimidazolium on onions [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 102-107 (in Chinese)