三氯卡班可以影響腎小管上皮細胞的屏障功能

楊峰，王京真，劉文華,#

1. 汕頭大學海洋生物研究所 廣東省海洋生物技術重點實驗室，汕頭 5150632. 欽州學院，欽州 535000

三氯卡班可以影響腎小管上皮細胞的屏障功能

楊峰1，王京真2,*，劉文華1,#

1. 汕頭大學海洋生物研究所 廣東省海洋生物技術重點實驗室，汕頭 5150632. 欽州學院，欽州 535000

三氯卡班(TCC)是一種被廣泛應用于個人護理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑，已在多種環境介質和生物體中檢出。因其潛在的環境蓄積、生物累積和生物毒性效應，日益受到學者們的關注。借助TCC對NRK-52E(大鼠腎小管上皮細胞)的毒性暴露實驗，通過檢測細胞活力、以及與跨膜電阻和緊密連接相關的連接黏附分子1(JAM-1， junctional adhesion molecule 1)的蛋白表達水平，研究了TCC潛在的腎臟毒性效應。結果顯示，10 μmol·L-1TCC處理48 h時培養細胞呈現不規則的集落；10 μmol·L-1和20 μmol·L-1TCC處理NRK-52E 24 h、48 h和72 h后可以顯著抑制細胞生長；3.57 μmol·L-1TCC(生長抑制的48 h-IC20)處理NRK-52E 48 h可以顯著抑制細胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達量，并降低跨膜電阻，影響腎臟的屏障功能。本研究的結果能夠為進一步揭示TCC對動物的毒害機制、評估其對動物的健康風險提供數據支持。

TCC；NRK-52E細胞；細胞毒性；屏障功能

三氯卡班(1-(4-chlorophenyl)-3-(3,4-dichlorophenyl) urea, triclocarban, TCC)是一種廣泛運用于個人護理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑[1-3]，常添加在人們日常使用的肥皂、洗面奶、沐浴露、美容化妝用品和牙膏中[4-5]。因為較大的環境輸入量以及其具有環境蓄積、生物累積和生物毒性等特征，已成為目前人們最為關心的污染物之一[6]。

20世紀70年代，歐盟基于毒理動力學的研究將TCC認定為安全、無毒的殺菌劑，可添加于人們日常的護理用品中(personal care products, PCP)[7]。相比于毒性研究較為深入的三氯生(TCS)，TCC一直被認為是較好的替代劑。由此TCC的使用量急劇增加。在化妝用品中TCC的含量可達0.2%；在抗菌皂中，它的使用量一般高于1.5%；在洗滌類用品中的允許濃度最高可達2%[2]。有報道顯示，TCC在美國的消耗量每年可達1百萬磅[1-2]，而在中國的年消耗量可高達1 220 t[8]。隨著TCC的大量使用，其在環境中的排放量逐年增加；又因其較為穩定的理化屬性和較高的環境持久性(在沉積物、土壤、水和空氣中的半衰期分別為540、120、60和0.75 d)[7,9]，目前已成為水環境中最常檢測到的污染物之一。其在北美、歐洲和亞洲污水中的濃度可以達到μg·L-1級[9-10]，在中國五大河(遼河、海河、黃河、珠江和東江)的表層水和沉積物中的檢出率為100%，而且在表層水和沉積物中的濃度高達338 ng·L-1和2 723 ng·g-1[8]，表明TCC在中國水體環境中的污染檢測和風險評估已成為環境工作者所面臨的重要問題之一。

環境中大量的TCC(尤其是水環境中的TCC)對人與水生動物具有潛在的危害性。最新的研究表明TCC可以通過皮膚、口腔黏膜和胃腸道被人體吸收[11-13]。特別是在一次全身洗浴中會有0.39%至0.6%(約0.54 mg)的TCC會被吸收[13]，而后約21%隨尿代謝排出體外[7,13]。因此腎臟有可能成為TCC毒性作用的靶器官，對其進行毒性效應的評估具有重要價值。

連接黏附分子1(JAM-1, junctional adhesion molecule 1)是緊密連接的重要組分，它參與旁通透性、細胞極性、黏附、遷移和血管生成等重要過程[14-15]。急性腎損傷、多囊腎、腎結石[16]和腎癌[17]等多種腎疾病與緊密連接的功能紊亂有關。因此作為緊密連接重要組分的JAM-1對腎功能的正常發揮有重要作用。

目前，大多數關于TCC的研究主要集中在它的分布、生物降解和內分泌干擾等方面。TCC腎毒性的研究還未見報道。本研究通過TCC對NRK-52E細胞的毒性暴露實驗，結合顯微鏡下的細胞形態觀察，并檢測細胞生長、跨上皮電阻以及與腎臟功能密切相關的JAM-1蛋白水平，首次借助體外模型證實了TCC可以改變NRK-52E的屏障功能，可為進一步開展體內實驗、綜合評價TCC的腎臟毒性效應提供科學支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。細胞培養基為DMEM，添加5%(V/V)的胎牛血清，1×雙抗(100 U·mL的青霉素，100 μg·mL的鏈霉素)；在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。

儀器：艾本德170R二氧化碳培養箱(Eppendorf，德國)；SW-CJ-IF型凈化工作臺(蘇州安泰)；Infinite M200 PRO酶標儀(Tecan，瑞士)。

試劑：三氯卡班(TCC，純度≥ 99%)、二甲基亞砜(DMSO，純度≥ 99.5%)、DMEM培養基，均購自美國Sigma；CCK-8和DCFH-DA熒光探針購自中國碧云天；胎牛血清購自美國賽默飛。

1.2 細胞形態觀察

取對數生長期的NRK-52E細胞接種于12孔板中。待24 h細胞完全貼壁，吸去上清，用10 μmol·L-1TCC處理48 h。用倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.3 CCK-8法測定細胞活性

取對數生長期的NRK-52E細胞，接種于96孔板。待24 h細胞完全貼壁，吸去上清，然后分別加入0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的TCC暴露處理[18-21]；對照組添加等體積的體積分數為0.1%的DMSO。暴露處理24 h、48 h和72 h。每組設置6個復孔，重復3次。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養箱中孵育1 h，用酶標儀檢測在450 nm處的吸光值。

1.4 跨上皮細胞電阻檢測

取對數生長期的NRK-52E細胞，接種于transwells(0.4 μm, Corning Life Sciences)，使用Millipore Millicell-ERS來測量跨膜電阻，當電阻穩定時，用3.57 μmol·L-1(20%的生長抑制效應濃度，IC20)TCC暴露處理48 h；對照組添加等體積的體積分數為0.1%的DMSO；空白組無細胞。暴露48 h，再次測量跨膜電阻，重復3次，細胞單層跨膜電阻=(實測-空白)×transwells有效膜面積，單位用Ω·cm2表示。

1.5 Western blot檢測JAM-1的表達

取對數生長期的NRK-52E細胞，接種于12孔板中，待24 h細胞完全貼壁，吸去上清，用IC203.57 μmol·L-1TCC(排除高濃度TCC導致細胞死亡對實驗的影響)暴露處理；對照組添加等體積的體積分數為0.1%的DMSO。暴露48 h，提取總蛋白，然后進行電泳、轉膜、孵育抗體。一抗(JAM-1和GAPDH)4 ℃孵育過夜，LEC化學發光顯色。

1.6 數據統計與分析

采用SSPS 21.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數據進行方差分析，來檢驗對照組和藥物暴露組之間的差異(P < 0.05表示顯著差異)。

2 結果(Results)

2.1 TCC對NRK-52E細胞形態的影響

通過倒置顯微鏡觀察發現對照組NRK-52E細胞密度相對較高，細胞邊緣光滑清晰而且貼壁性好；而處理組(10 μmol·L-1TCC處理48 h時)細胞呈現不規則的集落如圖1所示。

2.2 TCC對NRK-52E細胞存活率的影響

CCK-8是一種廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性檢測的快速和靈敏的方法。如圖2所示，NRK-52E在TCC作用24 h、48 h和72 h后，細胞存活率隨著濃度增加而降低，10和20 μmol·L-1處理組存在顯著差異(P < 0.05)，而且同一濃度下隨著暴露時間的增加細胞存活率下降，呈現顯著的時間-劑量效應關系。利用GraphPad Prism 5.0軟件擬合計算24 h、48 h和72 h的IC50和IC20。IC50分別為18.53、14.00和11.06 μmol·L-1；IC20分別為5.31、3.57和2.54 μmol·L-1。

2.3 TCC可以影響NRK-52E的屏障功能

NRK-52E的屏障功能可以通過跨膜電阻來評估。如圖3所示，3.57 μmol·L-1TCC暴露可以顯著降低跨膜電阻(P < 0.05)。

圖1 三氯卡班(TCC)對NRK-52E細胞形態的影響注：A為正常對照；B為10 μmol·L-1 TCC處理48 h。Fig. 1 Effect of triclocarban (TCC) on morphology of NRK-52E cellsNote: A- normal cultured； B- 10 μmol·L-1 TCC treatment for 48 h.

圖2 TCC對NRK-52E細胞具有生長抑制作用Fig. 2 Triclocarban inhibits the growth of NRK-52E cells

圖3 TCC對NRK-52E跨膜電阻(TER)的影響Fig. 3 TCC alters transepithelial electrical resistance (TER) in NRK-52E

2.4 TCC可以降低NRK-52E細胞基因JAM-1的蛋白表達

如圖4所示，緊密連接分子JAM-1在3.57 μmol·L-1TCC處理48 h后表達量顯著降低(P < 0.05)。

圖4 通過Western blot檢測TCC對NRK-52E細胞JAM-1表達的影響Fig. 4 Effects of TCC on the expression of JAM-1 in NRK-52E cells

3 討論(Discussion)

TCC是一種廣泛運用于個人護理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑[1-3]，在被人體或水生動物吸收[11-12,22]并排泄出體外[7,13]的過程中可能引發毒性作用。然而目前相關TCC的毒理學研究較多集中在其內分泌干擾特性上[19]，對動物體危害的其他方面報道相對較少。因此，本研究主要通過利用NRK-52E細胞探討了TCC對腎臟可能引起的毒性效應。

腎小管上皮細胞的屏障功能對腎發揮正常生理功能有重要作用[23]，我們通過跨膜電阻來評估腎的屏障功能，可以發現TCC(IC20的3.57 μmol·L-1)可以明顯降低NRK-52E細胞跨膜電阻(P < 0.05)。有文獻報道改變細胞間的緊密連接可以改變腎小管上皮的屏障功能，進而誘發腎臟疾病[23]。本研究中TCC(3.57 μmolL-1)染毒NRK-52E 48 h，可以抑制細胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達，推測TCC可能通過抑制JAM-1的表達進而影響腎臟的屏障功能。

與此同時，細胞間的連接能促進同型細胞間的黏附而且可以轉導信號內信號，這些信號可以調節細胞生長和凋亡。JAM-1是一種跨膜的緊密連接蛋白，敲除JAM-1后可以抑制細胞的生長，并顯著增加細胞的凋亡[24]，這與本研究中的CCK-8實驗結果相符。

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Triclocarban Alters Barrier Function in NRK-52E Cells

Yang Feng1, Wang Jingzhen2,*, Liu Wenhua1,#

1. Marine Biology Institute, Shantou University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology, Shantou 515063, China2. Qinzhou University, Qinzhou 535000, China

24 May 2016 accepted 5 August 2016

Triclocarban (TCC) is a broad-spectrum, lipophilic, antimicrobial additive that is largely applied in a variety of personal care products (PCPs). Now, this chemical has been detected in various environmental matrices including sediments, fishes and water. Because of its potential accumulation capacity and biological toxicity, TCC is now increasingly drawing the attention of the researchers. In this study, the potential renal toxicity was evaluated using NRK-52E cells, and we analyzed cell viability, transepithelial electrical resistance (TER) and the protein levels of junctional adhesion molecule 1 (JAM-1) which is closely related to cellular tight junction. The results showed that irregular colonies occurred after exposing NRK-52E cells to 10 μmol·L-1TCC for 48 h, and the cell growth was also significantly inhibited in a dose- and time-dependent manners. Also, the TER and the protein levels of JAM-1 decreased after treatment with 3.57 μmol·L-1TCC for 48 h, implying the potential adverse effect of TCC on the barrier function of the kidney. Therefore, this study illustrated the in vitro nephrotoxicity of TCC, and the results can provide evidences for future study on toxicity mechanism of TCC and the possible health assessment on animals.

triclocarban; NRK-52E cell; cytotoxicity; barrier of kidney

國家自然科學基金(41306180，41176155)；教育部高等學校博士點科研基金項目(20134402110005)；海洋公益性行業科研專項經費項目(201405007)；廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室自主項目(2016ZC02)

楊峰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為分子毒理學，E-mail: yangfeng20082407@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wangjingzhen-1@163.com；

10.7524/AJE.1673-5897.20160524003

2016-05-24 錄用日期：2016-08-05

1673-5897(2017)2-177-05

X171.5

A

王京真(1982-)，男，博士后，研究方向為體外毒理學、生態和演化、保護生物學。

共同通訊作者簡介：劉文華(1970-)，男，教授，研究方向為生態毒理學、海洋哺乳動物保護生物學。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: whliu@stu.edu.cn；

楊峰， 王京真， 劉文華. 三氯卡班可以影響腎小管上皮細胞的屏障功能[J]. 生態毒理學報，2017, 12(2): 177-181

Yang F, Wang J Z, Liu W H. Triclocarban alters barrier function in NRK-52E cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 177-181 (in Chinese)