ARHI基因轉染胰腺癌PANC1細胞后對趨化因子及其受體相關基因表達的影響

胡珊珊 楊紅 王健 姚堯 朱永健 錢家鳴

·論著·

ARHI基因轉染胰腺癌PANC1細胞后對趨化因子及其受體相關基因表達的影響

胡珊珊 楊紅 王健 姚堯 朱永健 錢家鳴

目的 觀察ARHI基因轉染胰腺癌PANC1細胞后對趨化因子及其受體相關基因mRNA表達的影響。方法 采用脂質體法將表達ARHI基因的質粒pLNCX2-ARHI-EGFP、空質粒pLNCX2-EGFP轉染胰腺癌PANC1細胞，應用G418篩選穩定轉染細胞株。采用基因芯片RT2ProfilerTMPCR Array行實時定量PCR，分析轉染細胞的基因表達，包括84個趨化因子及受體相關基因，采用Real-time PCR法驗證與血管生長相關基因mRNA的表達。結果 ARHI轉染組細胞有36個基因mRNA表達下調，9個基因mRNA表達上調，39個基因mRNA表達變化無意義。其中腫瘤轉移和侵襲相關基因CXCL12、CXCR4表達顯著下調(<-6倍)，MMP-2表達輕度下調(<-2倍)；促腫瘤血管生成相關基因CCL2、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12、CXCR4表達顯著下調，CXCL3、CCR1、CCR2表達輕度下調；抗腫瘤血管生成相關基因CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3表達顯著上調(>6倍)；遠端器官定位浸潤和潛伏相關基因CXCL12、CXCR4、CCR7表達顯著下調，CXCR5表達輕度下調；腫瘤免疫調節相關基因CXCL8、CXCR1、CCR7表達顯著下調。Real-time PCR驗證CXCL1、CXCL8、CXCR4、CXCR3結果與PCR Array檢測結果一致。結論 ARHI基因可抑制胰腺癌細胞增殖、轉移、血管生成、免疫調節相關趨化因子及其受體的基因表達。

胰腺腫瘤； ARHI基因； 趨化因子類； 受體，趨化因子

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81072055)

ARHI基因是Yu等[1]發現的一個母源性印跡基因，為Ras超家族成員之一。既往研究發現，ARHI基因可抑制胰腺癌細胞增殖和生長，誘導細胞凋亡和自噬[2]。趨化因子是細胞因子家族成員之一，根據其氨基酸N端半胱氨酸殘基的不同，可分為CXC、CC、C和CX3C 4個亞家族；趨化因子通過與受體結合參與細胞的生長、發育、分化、凋亡及組織損傷等多種生理和病理過程。有研究顯示趨化因子及其受體的定向結合可影響腫瘤發展、轉移和血管生成[3-4]，但ARHI基因對于趨化因子和受體的影響仍未知。本研究通過檢測并分析ARHI基因對胰腺癌細胞增殖、轉移和血管生成相關的84個細胞趨化因子及其受體基因表達的影響，探討ARHI基因抑制胰腺癌細胞的相關分子機制。

材料與方法

一、穩定轉染ARHI基因的PANC1胰腺癌細胞株的建立

胰腺癌細胞株PANC1來源于ATCC庫(American type culture collection)，常規培養及傳代。取對數生長期細胞接種于6孔板，培養至細胞融合度達到70%～80%時用轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)按質粒∶lipo2000=4.0 μg∶10 μl將插入ARHI質粒pLNCX2-ARHI-EGFP(質粒為本實驗室構建[5])、空載體質粒pLNCX2-EGFP轉染細胞，同時設單加脂質體及僅加培養液的對照組。每組3個復孔。轉染48 h后，加入終濃度為9 00 μg/ml的G418篩選14 d，建立穩定轉染pLNCX2-ARHI-EGFP和pLNCX2-EGFP的細胞株。

二、實時定量PCR芯片檢測腫瘤血管生成相關趨化因子及其受體基因mRNA的表達

收集各組細胞，采用Trizol(Gibco公司)提取細胞總RNA，應用逆轉錄試劑盒(ABI公司)逆轉錄成cDNA。采用高通量基因芯片RT2ProfilerTMPCR Array(Qiagen公司)檢測84個基因的mRNA表達，包含CXCL、CXCR、CCL、CCR及相關家族。以GAPDH為內參。PCR反應體系為25 μl， 其中2×PCR SYBGREEN mix 12.5 μl，模板量相當于100 ng的總RNA。PCR反應條件：95℃ 30 s、95℃ 15 s、60℃ 1 min，循環40次。根據2-△△Ct公式，以pLNCX2-EGFP組為1，計算mRNA相對表達倍數。實驗重復3次，取均值。表達倍數>2倍為輕度上調，<-2倍為輕度下調，>6倍為顯著上調，<-6倍為顯著下調。

三、腫瘤血管生成相關趨化因子和受體基因mRNA表達的驗證

挑選表達水平有顯著差異的腫瘤血管生成相關趨化因子和受體及CXCR2(芯片中無該基因)。應用Beacon Designer 7.0軟件設計引物，各引物序列見表1。采用Real-time PCR反應進行驗證，以GAPDH為內參。所有條件均同前，根據公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。

表1 腫瘤血管生成相關趨化因子和受體的引物序列

四、統計學處理

結 果

一、ARHI基因對趨化因子及其受體家族相關基因表達的影響

pLNCX2-ARHI-EGFP組與pLNCX2-EGFP組基因表達見表2。pLNCX2-ARHI-EGFP組中36個基因mRNA表達下調，其中12個顯著下調(<-6倍)；9個基因mRNA表達上調，其中5個顯著上調(>6倍)；39個基因mRNA表達無變化。其中與腫瘤轉移和侵襲相關基因CXCL12和CXCR4表達顯著下調(<-6倍)，MMP-2表達輕度下調(<-2倍)；促腫瘤血管生成基因CCL2、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12、CXCR4表達顯著下調(<-6倍)，CXCL3、CCR1、CCR2表達輕度下調(<-2倍)；抗腫瘤血管生成基因CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3表達顯著上調(>6倍)，以CXCL9最明顯，達27.8倍；與對遠端器官定位浸潤和潛伏相關基因CXCL12、CXCR4、CCR7表達顯著下調(<-6倍)，CXCR5表達輕度下調(<-2倍)；與腫瘤免疫調節相關基因CXCL8、CXCR1、CCR7表達顯著下調(<-6倍)，其中以CXCR1尤為明顯，達-41.3倍。

表2 pLNCX2-ARHI-EGFP組和pLNCX2-EGFP組基因表達的差異

注：a：顯著下調；b：輕度下調；c：顯著上調；d：輕度上調

二、ARHI基因對腫瘤血管生成相關趨化因子和受體mRNA表達的影響

Real-time PCR驗證結果與PCR Array結果一致，pLNCX2-ARHI-EGFP組CXCL8、CXCL1、CXCR4 mRNA表達較pLNCX2-EGFP組顯著下調(P值分別為0.0243、0.0388、0.0142)，CXCR3表達顯著上調(P=0.0481)，CXCR2表達亦顯著下調(P=0.0002)，差異均有統計學意義(表3)。

表3 穩定轉染pLNCX2-ARHI-EGFP組與空載體組基因mRNA相對表達量的比較

基因pLNCX2-EGFP組pLNCX2-ARHI-EGFP組P值CXCL80.00066±0.000130.00029±0.000130.0243CXCR20.01559±0.000360.00221±0.001650.0002CXCL10.00065±0.000230.00024±5.164e-0050.0388CXCR40.00127±0.000220.00074±3.609e-0050.0142CXCR30.00091±0.000920.00260±0.000490.0481

討 論

ARHI基因是母源性印跡基因，為Ras超家族成員之一。ARHI基因編碼的蛋白在人類多種組織如卵巢、乳腺中表達，但在乳腺癌、卵巢癌中表達下調。本課題組前期研究發現[6-8]，ARHI基因可以抑制胰腺癌細胞的增殖，促使細胞周期停滯，誘導細胞凋亡及自噬發生，抑制細胞遷移，是胰腺癌發生和發展過程中的重要抑癌基因。

研究顯示腫瘤細胞的生長和轉移受到微環境的調控，而趨化因子在微環境調節中起重要作用。趨化因子與受體結合后促使腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成從而促進腫瘤生長、轉移[8-9]。谷氨酸-亮氨酸-精氨酸陽性(glntamic acid-leu-cine-arginine positive, ELR+)的CXC類趨化因子(如CXCL8)具有促腫瘤血管生成的作用，高轉移性胰腺癌移植瘤CXCL8高表達與腫瘤生成和轉移高度相關，給予外源性CXCL8可促進血管生成[10]。胰腺癌組織中CXCR4表達和微血管密度(MVD)均較正常胰腺組織顯著提高，且CXCR4的表達與MVD有顯著相關性[11]。ELR陰性以及能被干擾素誘導產生的CXC類趨化因子(如CXCL10)有抗腫瘤血管生成作用[12]。Zhao等[13]研究發現，其他家族中相關基因CCL21和CCR7在胰腺癌組織中高表達，且與MVD呈正相關，提示CCR7與腫瘤血管生成相關。

本研究結果顯示，ARHI基因轉染后PANC1細胞CXCL8/CXCR2、CXCR4和CXCL1的表達顯著下調，而CXCR3的表達顯著上調，提示ARHI可能通過抑制CXCL1和CXCR8/CXCR2、CXCL12/CXCR4及CCL21/CCR7通路，上調CXCL9、CXCL10和CXCL11/CXCR3通路抑制胰腺癌組織血管生成。為了進一步驗證ARHI基因對這些細胞因子表達的影響，本研究對報道較多的CXCL1、CXCL8、CXCR3和CXCR4、CXCR2進行驗證，結果發現，這些細胞因子的表達差異均有統計學意義，證實ARHI基因能抑制CXCL1、CXCL8、CXCR4和CXCR2 mRNA的表達，增強CXCR3 mRNA的表達。

本研究結果還顯示，pLNCX2-ARHI-EGFP組細胞CXCL12、CXCR4和CCR7表達顯著下調，CXCR5表達輕度下調，提示ARHI可能通過抑制CXCL12/CXCR4、CCL21/CCR7及CXCL13/CXCR5通路進一步抑制腫瘤向遠端器官的定位轉移；CXCL8、CXCR1和CCR7表達顯著下調，提示ARHI可能通過CXCR8/CXCR1和CCR7抑制腫瘤的免疫逃避。

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(本文編輯：冀凱宏)

Effects of ARHI gene transfection on chemokines and receptors related gene expression profile of PANC1 cells

HuShanshan,YangHong,WangJian,YaoYao,ZhuYongjian,QianJiaming.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionMedicalHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China

QianJiaming,Email:qianjiaming@126.com

Objective To investigate the effects of ARHI transfection on the chemokines and receptors related gene expression profile of PANC1 cells. Methods Plasmids expressing ARHI and empty plasmid were transfected into PANC1 cells, and the stably expressed cell lines were established by using G418. mRNA expression of chemokines and receptors related genes was detected by PCR Array. Real-time PCR was used to detect mRNA expression of the genes related vascular growth. Results In cells transfected with ARHI gene, the expression levels of mRNA of 36 genes were down-regulated, and 9 were up-regulated. Among the genes related to tumor metastasis and invasion CXCL12 and CXCR4 were significantly down-regulated (<-6 folds), and MMP-2 was slightly down-regulated (<-2 folds). Among the genes related to tumor angiogenesis, pro-angiogenesis genes including CCL2, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL12 and CXCR4 were significantly down-regulated, and pro-angiogenesis genes including CXCL3, CCR1 and CCR2 was slightly down-regulated. Anti-angiogenesis genes including CXCL9, CXCL10, CXCL11 and CXCR3 were significantly up-regulated (>6 folds). Among the genes related to the localization of distant organ infiltration and latency, CXCL12, CXCR4 and CCR7 were significantly down-regulated,and CXCR5 was slightly down-regulated.Among the gene with tumor immunity,CXCL8,CXCR1 and CCR7 were significantly down-regulated. Gene expression of CXCL1,CXCL8,CXCR4 and CXCR3 detected by Real-time PCR were consistent with PCR array. Conclusions ARHI gene inhibits the expression of chemokines and receptors related to tumor metastasis,angiogenesis and tumor immunity.

Pancreatic neoplasms; ARHI gene; Chemotactic factors; Receptors, chemokine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.03.007

100730 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院，北京協和醫院消化科

錢家鳴，Email：qianjiaming@126.com

國家自然科學基金(81072055)

2016-02-04)