DC-CIK與CIK體外培養對包含HBV基因的HepAD38細胞的殺傷效果研究*

龔 覓 舒 丹

DC-CIK與CIK體外培養對包含HBV基因的HepAD38細胞的殺傷效果研究*

龔 覓①舒 丹①

目的：研究乙型肝炎病毒抗原致敏的樹突狀細胞（DC）和CIK細胞共同培養后對HepAD38細胞（含整合HBV基因組）的殺傷作用。方法：從乙肝患者外周血中提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分為兩組，研究組培養DC，培養DC第5天加入乙肝抗原并收獲DC，然后加入CIK細胞，培養出DC-CIK細胞；對照組單獨培養CIK細胞。兩組在培養15 d后分別收獲DC-CIK細胞與CIK細胞，同時作為效應細胞，把含有乙肝病毒的HepAD38細胞作為靶細胞，分別在5∶1、10∶1的效靶比時進行殺傷試驗，使用LDH釋放法測定殺傷活性，并用熒光擴增法檢測殺傷試驗后培養基內HBV-DNA水平。結果：研究組的DC-CIK細胞的5∶1效靶比時的平均殺傷率為（54.4±6.3）%、10∶1效靶比時的平均殺傷率為（71.5±4.5）%，均明顯高于對照組CIK細胞的（42.4±3.0）%、（59.4±4.5）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。研究組的DC-CIK細胞5∶1效靶比時的培養基內的HBV-DNA平均為（1.20±0.30）×106/mL、10：1效靶比時的培養基內的HBV-DNA平均為（1.64±0.60）×107/mL，均明顯高于對照組CIK細胞的（0.90±0.23）×106/mL、（1.28±0.23）×107/mL，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：CIK細胞與DC-CIK細胞對HepAD38細胞均具有殺傷效果，而且隨著效靶比的升高，殺傷效果增強。同時，乙肝抗原致敏的DC誘導出的特異性CIK細胞（DC-CIK細胞），能夠有效提高CIK細胞對乙肝病毒感染的HepAD38細胞的殺傷作用，其殺傷作用可能與DC被乙肝抗原致敏后誘導出特異性CIK，增強各自療效有關。

DC； CIK； HepAD38； 效果

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界范圍性質的疾病問題，其中我國是HBV感染的主要國家之一[1]，HBV容易發展成為慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B virus，CHB），而CHB則會發展為肝硬化或者肝癌，一直以來是我國乃至世界人民生命威脅的傳染病之一。國內HBV感染多數在圍產期或幼年時期發生，因此易產生免疫耐受，體內病毒清除困難，長期的慢性感染還會導致出現各種并發癥，因此如何清除HBV是CHB治療的重難點。目前國內外常規的治療方法以藥物治療為主，臨床上主要采用核苷酸類似物（NAs）與干擾素（IFN）進行抗病毒治療，這種藥物治療能夠有效抑制病毒的復制，但是治療過程中容易出現病毒耐藥、停藥復發等情況，難以確定治療終點[2-3]。

HepAD38細胞是一種可以分泌HBV病毒顆粒的細胞系，因此，理論上對HepAD38細胞進行殺傷可以有效抑制HBV-DNA，達到良好的臨床療效。而CIK細胞對HepAD38具有一定的殺傷力，對CHB具有良好的療效，患者治療后其HBV-DNA滴度下降[4]，因此如何誘導針對HBV的特異性CIK細胞來提高對HepAD38細胞的殺傷力是一個研究方向。本文根據大量文獻，通過體外培養，以樹突狀細胞（dendritic cell，DC）誘導出特異性CIK細胞（DC-CIK細胞），來探討DC-CIK對HepAD38細胞的殺傷及HBV-DNA的抑制效果，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 外周血選自2016年5-12月本院收治的符合文獻[5]中慢性乙型肝炎防治指南的HBeAg陽性CHB患者，采用深圳市金佳禾生物醫藥有限公司提供的專用培養DC試劑，離心機為貝克曼公司生產提供。

1.2 DC-CIK及CIK培養方法 提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分為兩組，每組15份，研究組培養DC細胞，培養DC第5天加入乙肝抗原并收獲DC，然后加入CIK細胞，培養出DC-CIK細胞；對照組單獨培養CIK細胞。具體方法如下：（1）采集20 mL外周血，密度梯度離心分離PBMC，用AIMV（CTS）培養基調整細胞數目為（4～6）×106個細胞/mL，接種于6孔板內，1 mL/孔，放入培養箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）貼壁培養2.5 h。（2）配置DC培養基，DF-01為30X，吸出自然融化的DF-01 400 μL用AIMV（CTS）培養基定容至12 mL備用。（3）取出6孔板，輕搖后將孔內的培養基吸出加入至培養瓶內做CIK培養。用1 mL的CIK培養基滴洗孔板，每孔重復2次，直至顯微鏡下觀察懸浮細胞比例低于5%，將收集的懸浮細胞加入CIK因子（第1天加入γ因子，第2天加入IL-1α、IL-2、CD3），放入培養箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）培養CIK細胞，然后每3天換液并補加IL-2因子。（4）每孔加入1 mL的DC培養基，放入培養箱中，記為第0天。（5）第3天，按照步驟2準備DC培養基，每孔補充1 mL。（6）第5天，每孔分別加入50 μL乙肝表面抗原和乙肝e抗原、100 μL DF-02、100 μL DF-03、10 μL DF-04，誘導刺激40～48 h。（7）第7天，吹打6孔板，將懸浮的細胞收集在離心管中，再用預冷的鹽水每孔洗滌2次，收集懸浮細胞與CIK混合并繼續培養，每3天換培養液并補加IL-2，第14天收獲CIK和DC-CIK細胞。

1.3 LDH釋放法測定殺傷活性 用96孔板，每孔加入100 μL濃度為1×106/mL的HepAD38細胞，取培養好的CIK和DC-CIK計數，分別配成含量為5×106/mL和1×107/mL的細胞懸液，各加100 μL（效靶比為5∶1、10∶1），放置培養箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）培養4 h，離心，吸上清到另一個96孔板內，每孔加試劑盒底物，放培養箱中（37 ℃，CO2濃度為5%），顯色30 min，492 nm吸光度測OD值。細胞殺傷率=（檢測值-陰性對照/陽性對照-陰性對照）×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x－±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同效靶比時的殺傷效果比較 研究組的DC-CIK細胞的5∶1、10∶1效靶比時的平均殺傷率均明顯高于對照組的CIK細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組不同效靶比時的殺傷效果比較 %

2.2 兩組不同效靶比時的培養基內HBV-DNA數比較 研究組的DC-CIK細胞5∶1、10∶1效靶比時的培養基內的HBV-DNA均明顯高于對照組的CIK細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組不同效靶比時的培養基內HBV-DNA數

3 討論

DC及CIK已被應用在諸多腫瘤疾病中[6-7]，王斌等[8]報道稱DC與CIK對于結腸癌細胞SW1116均具有良好的殺傷效果，殺傷活性能夠達到64.1%與67.7%。楊曉亞等[9]則利用DC誘導CIK特異性細胞對肝癌患者HuH-7細胞具有較強的殺傷活性，而且在相同效靶比時，DC-CIK細胞的殺傷效果明顯優于單獨CIK細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。李可等[10]也表示誘導后的DC-CIK細胞對肺癌細胞的殺傷效果較CIK高，而且報告中比較了10∶1、20∶1、50∶1三種效靶比，隨著效靶比時的增高，DC-CIK的殺傷效果增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。CIK細胞是患者外周血單核細胞（PBMC）在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞[11-12]，其中CD3+、CD56+T細胞群是抗病毒、直接殺傷腫瘤細胞的主要免疫細胞，很早時應用在抗腫瘤過繼細胞免疫治療中[13-14]。應用CIK細胞治療HBV發現其對HBV-DNA的應答效果很好，CIK對CHB具有良好的臨床效果，患者使用這種治療方法可使HBV-DNA滴度明顯降低[4]，而且對一些肝硬化患者自體回輸CIK細胞后，其HBV-DNA抑制效果明顯變好。因此，CIK細胞對HepAD38具有一定的殺傷力，對于CHB具有效果顯著的HBVDNA抑制效果。DC則是人體最重要、功能最強的抗原提呈細胞，能夠激發T細胞復制增殖，同時產生免疫應答能力[15-16]。DC捕獲HBV后，提呈給CD4+、CD8+T細胞，CD8+T細胞能夠對包含HBV的肝細胞中的抗原肽進行識別、活化并與之結合，從而溶解肝細胞進而使肝細胞凋亡。但是DC也能夠同時識別并活化機體的NK以及抗體依賴性細胞毒性細胞，從而對CHB患者的肝細胞造成損害[17-18]。因此CHB患者體內的HBV會造成DC數量減少，抗原提呈功能降低，使其分泌細胞因子的能力減弱，T細胞無法起到應答效果。因此，對于CHB患者來說，提高DC的數量對于清除HBV也是非常重要的。

從本文表1中可知，經過誘導后的研究組特異性CIK細胞（DC-CIK）在5∶1效靶比及10∶1效靶比時的殺傷效果為（54.4±6.3）%與（71.5±4.5）%，均比對照組單獨CIK的殺傷率高（P＜0.05），而且研究組與對照組的10∶1效靶比相對5∶1效靶比時的殺傷活性更高，這表示隨著效靶比的升高，CIK細胞的殺傷效果增強。表2中顯示研究組的培養基內檢測到的HBV-DNA數明顯高于對照組，同時研究組與對照組的10∶1效靶比相對5∶1效靶比時的HBV-DNA檢測量多，這是因為免疫細胞殺傷性越強，HepAD38細胞裂解越多，HepAD38細胞內HBV釋放到培養基就越多，所以檢測出的HBVDNA水平就越高，因此可以說明DC-CIK較CIK有更好的殺傷活性，對HepAD38細胞殺傷效果更好。筆者認為這主要是因為DC-CIK細胞相對于單獨的CIK細胞具有更強的免疫活性。DC與CIK細胞共同培養后，DC能夠發揮其最大的優勢-激活T細胞增殖并建立免疫應答，因此增強了CIK細胞的免疫活性，使其對HepAD38細胞中的HBV-DNA抑制效果更好。而且隨著效靶比的增多，殺傷效果增強，這也可以說明當患者體內DC-CIK細胞增多或者HBV-DNA降低時，效果更好，不會有耐性反應。

綜上所述，筆者認為HBsAg致敏的DC跟CIK共同培養后誘導出HBsAg的特異性CIK對于HepAD38細胞的殺傷效果更好，其殺傷作用可能與DC被乙肝抗原致敏后誘導出特異性CIK，增強各自療效有關。

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Study the Killing Effect of DC-CIK and CIK in Vitro on HepAD38 Cells Containing HBV Gene/

GONG Mi，SHU Dan.//
Medical Innovation of China，2017，14（18）：127-130

Objective：To study the killing effect of hepatitis B virus antigen sensitized dendritic cells (DC) and CIK cells on HepAD38 cells (including the integrated HBV genome) after co culture.Method：PBMC was extracted from peripheral blood of hepatitis B patients and divided into two groups，the study group cultured DC，cultured DC for fifth days，added hepatitis B antigen and harvested DC，then added CIK cells to culture DC-CIK cells；the CIK cells were cultured alone in the control group.In the two groups，DC-CIK cells and CIK cells were harvested after 15 d culture，and as the effector cells，the HepAD38 cells containing HBV were used as target cells，in effect the target 5∶1，10∶1 ratio was measured using LDH cytotoxicity assay，cytotoxicity release assay and fluorescence amplification method to detect cytotoxicity after HBV-DNA in the culture medium.Result：The mean killing rate of DC-CIK cells at 5:1，10:1 target ratio in study group were (54.4±6.3)% and （71.5±4.5）%，higher than（42.4±3.0）% and （59.4±4.5）% of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The level of HBV-DNA culture medium of 5∶1 cells and 10∶1 cells in the target ratio of DC-CIK in study group were （1.20±0.30）×106/mL and （1.64±0.60）×107/mL，higher than （0.90±0.23）×106/mL and （1.28±0.23）×107/mL of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：CIK cells and DC-CIK cells have a lethal effect on HepAD38 cells，and the effect target ratio increased，the killing effect is enhanced.At the same time，the hepatitis B antigen sensitized DC induced specific CIK cells （DC-CIK cells），can effectively improve the killing effect of CIK cells on hepatitis B virus infection of HepAD38 cells and its cytotoxicity DC and hepatitis B antigen sensitization induced specific CIK， enhance their curative effect.

DC； CIK； HepAD38； Effect

The Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518000，China

10.3969/j.issn.1674-4985.2017.18.036

2017-04-12） （本文編輯：張爽）

2015年深圳市科技計劃項目

（JCYJ20150402111430634）

①廣東省深圳市第三人民醫院 廣東 深圳 518000

龔覓