Promicol ATP微生物快速檢測系統在UHT滅菌奶商業無菌檢測上的應用研究

文/林木娣 黃詩韻 楊愛君 何 瑛

Promicol ATP微生物快速檢測系統在UHT滅菌奶商業無菌檢測上的應用研究

文/林木娣1黃詩韻2楊愛君1何 瑛1

（1 廣東燕塘乳業股份有限公司；2 廣州中實生物科技有限公司）

介紹一種微生物快速檢測系統，利用活體微生物中的三磷酸腺苷（ATP）作為標記分子，通過檢測超高溫（UHT）滅菌奶中微生物的ATP在反應過程中產生的熒光強度，可以間接測定樣品中的微生物含量。該方法具有簡便、快速、靈敏度高的優點，經驗證能與國標法商業無菌檢測達到一樣的篩查檢驗目的，能夠對UHT產品進行快速放行，在UHT滅菌乳與乳制品的質量監控中具有重要的意義。

三磷酸腺苷（ATP）；商業無菌檢測；超高溫（UHT）滅菌奶；快速檢測

乳與乳制品是大家公認的營養全面的食品，對改善居民的營養、平衡膳食結構、補鈣和增強體質均有重要的作用。超高溫（UHT）滅菌奶是其中的一種，因其保存方便、保質期長的特點，受到廣大消費者的喜愛。按照國家安全標準的要求，所有經過UHT滅菌的食品都需要經過商業無菌檢驗合格才能出售，因商業無菌的微生物檢驗[1]需耗時10 天以上，檢驗周期長給企業的倉儲、資金回籠等帶來較大的壓力，越來越多的企業迫切需要一種可靠的、穩定的、快速的微生物檢測方法來替代傳統的商業無菌檢驗方法，從而達到快速篩查放行的目的，為搶占市場及內部經營提供便利。

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物發光檢測方法具有簡便、快速、靈敏度高的優點，已廣泛應用在微生物檢測[2]、食品衛生監控[3]等領域，而歐洲、澳洲等地近年也致力于ATP微生物快速檢測系統在UHT滅菌奶的商業無菌檢驗的研究及推廣。

1 Promicol ATP微生物快速檢測系統

Promicol ATP微生物快速檢測系統是利用ATP生物發光原理對產品中的微生物進行檢測。本文從檢驗的原理、方法、操作便利性、檢測所需時間、方法可靠性及穩定性等方面進行研究和評估。

1.1 ATP生物發光檢測的原理

ATP生物發光檢測的原理[4]基于以下兩點。

（1）ATP作為活體微生物的標記分子，存在于所有活細胞中，可以作為能量的直接提供者，而對于在一定生理時期內的活體微生物，ATP濃度與活體微生物含量之間有良好的線性關系。

（2）在自然界中，ATP可誘導生物發光系統發光，一個常見例子為螢火蟲尾部的熒光素/熒光素酶反應，反應機制如下：

通過檢測ATP在反應過程中產生的熒光強度，可以間接測定樣品中的微生物含量。

1.2 ATP微生物快速檢測系統檢驗方法

試驗使用Promilite M4儀器（荷蘭Promicol）及UHT/ESL牛奶檢測試劑（荷蘭Promicol，貨號：399-4041201），Photonix?控制軟件分析。

產品經過48 h整包保溫后，取適量樣品置于ATP微生物檢測系統內，系統首先會使用Proase試劑（ATP雙磷酸酶）自動去除樣品中的非微生物ATP。然后微生物被Promex裂解劑裂解，其中的ATP被釋放，當加入Prolux試劑（含熒光素/熒光素酶）后，儀器對樣品中的發光量進行檢測，發光量換算為相對光子值（Relative Light Units，RLU）。無污染的樣品獲得低RLU結果，而污染樣品的RLU值則比干凈樣品高出3 倍或以上。

2 ATP微生物快速檢測系統驗證

驗證包括空白值的確認、目標菌（蠟樣芽飽桿菌）污染試驗及生產過程中受到微生物污染而出現壞包的樣品試驗，基本覆蓋了UHT滅菌奶生產過程中可能出現的微生物污染情況。

2.1 樣品ATP空白值確認

空白值即陰性（或無菌）樣品的RLU值。為了能夠靈敏地檢測出污染樣品中低水平微生物的ATP，選用的試劑需要有效地去除UHT滅菌奶樣品中可能存在的非微生物ATP（體細胞ATP或游離ATP），得到盡可能低并可重復獲得的空白值。

確定空白值后，判定各種樣品合格與否的具體標準如下。

（1）若樣品RLU值低于2 倍空白值，則該樣品為陰性。

（2）若樣品RLU值在2～3倍空白值，則結果視為可疑，該樣品應繼續保溫6 h后重新檢測，若樣品為陽性樣，RLU值會大幅度上升。

（3）若樣品RLU值大于3 倍空白值，則該樣品為陽性。

從每種UHT滅菌奶中選取10 盒陰性樣品（最好來自不同批次）進行保溫。保溫后每盒樣品均取4 個樣品進行重復性檢測，取所有陰性結果平均值作為空白值。如有異常樣品，需排除此樣品的檢測結果。具體操作如下：

將10 盒樣品放置于36 ℃保溫48 h，搖勻經過保溫的樣品后，用酒精消毒包裝，并從每個樣品中分別吸取4×50 μL到微孔板（無ATP）的4 個孔中，Promilite M4儀器自動完成整個“UHT/ESL樣品”程序，檢測結果以RLU表示。

在進行Promicol ATP系統檢測的同時，取1 mL樣品傾注平板，平板于36 ℃培養48 h。平板計數結果為陰性的樣品可以采用，結果為陽性的樣品需被排除。

本試驗測試了UHT滅菌純牛奶、UHT滅菌高鈣奶、UHT滅菌甜牛奶及UHT滅菌紅棗奶產品的空白值，并在控制軟件Photonix?中分別設置了上述產品合格與否的判定限值。

2.2 蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗

為了驗證Promicol ATP 系統能否足夠靈敏地檢測出UHT滅菌奶中低濃度的微生物污染，在純牛奶中人為加入蠟樣芽孢桿菌（革蘭氏陽性代表菌，有芽孢）進行試驗。

試驗前先使用LB液體培養基過夜復蘇蠟樣芽孢桿菌，然后使用無菌生理鹽水對菌株進行10 倍梯度稀釋（圖1）。分別將1 mL的10-5、10-6、10-7和10-8稀釋度的菌液傾注平板，平板于36 ℃培養48 h后進行菌落計數，確定稀釋菌液的初始濃度；同時接種1 mL該稀釋度菌液到樣品中，每個濃度的菌液稀釋液接種2 個樣品，樣品封口并置于36 ℃中保溫孵育48 h。保溫孵育后，對樣品進行ATP檢測。

在無菌條件下，從每個接種菌液的樣品中吸出4×50 μL置于4 個微孔中，放入Promilite M4后，儀器自動完成“UHT/ESL樣品”檢測程序（圖2）。在Photonix?軟件中，根據之前獲得的空白值，檢測結果自動解析成“合格”“可疑”及“不合格”。

Promicol ATP系統檢測后，將1 mL 樣品傾注平板，平板于36 ℃培養48 h。平板結果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）”。

2.3 自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗

在生產過程中收集到的一個自然陽性樣品（壞包），用無菌取樣環取樣劃線，分離并獲得污染微生物的單個菌株后，按2.2的操作，人工污染合格批次的UHT純牛奶樣品，并進行Promicol ATP系統檢測和平板法檢測的對比驗證。

圖1 對過夜復蘇的菌株進行10 倍梯度稀釋

圖2 檢測流程示意圖

2.4 Promicol ATP系統檢測與GB 4789.26-2013商業無菌對照試驗

抽取UHT滅菌奶產品10 盒，36 ℃保溫48 h進行Promicol ATP系統檢測；另取相同時間段產品10 盒按照GB 4789.26-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 商業無菌檢驗》的要求進行檢驗。

3 結果分析

3.1 樣品的ATP空白值

選取3 個批次共10 個樣品的UHT滅菌純牛奶進行試驗。經過36 ℃保溫48 h后，陰性樣品的空白ATP值檢測結果見表1。

從表1可知，使用本次選用的試劑盒檢測純牛奶樣品，在36 ℃保溫48 h的條件下，均能獲得低的且可重復的空白值。同時，所有樣品對應的平板檢測結果均為陰性，說明所選取的樣品ATP檢測結果均可采用。

根據同樣操作，對UHT滅菌高鈣奶、UHT滅菌甜牛奶及UHT滅菌紅棗奶產品進行空白值確認，在空白值平均值的基礎上，可以確定各種產品ATP檢測的“合格”“可疑”和“不合格”限值（表2）。

表1 36 ℃保溫48 h后陰性UHT滅菌純牛奶的ATP空白值

表2 UHT滅菌奶的“合格”“可疑”和“不合格”限值

3.2 蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗結果

選取合格批次的UHT滅菌純牛奶樣品進行試驗。根據2.2的操作，在樣品中接種不同濃度的蠟樣芽孢桿菌。人工污染的樣品代表實際過程中的不合格產品，對菌液稀釋液進行平板檢測是為了確認接種液的真實濃度（CFU/mL）。每個樣品接種1 mL菌液稀釋液，每個稀釋度進行2 個樣品重復。進行Promicol ATP檢測時，每個樣品檢測4 個重復，同時每個樣品均取1 mL做平板法對照，結果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）”。檢驗結果如表3所示。

從表3結果可知，接種了不同濃度的蠟樣芽孢桿菌的純牛奶樣品，經過36 ℃保溫48 h后，ATP檢測能獲得高RLU值。其中，接種了10-7稀釋度菌液的樣品說明，即使樣品中的初始污染菌量為1 CFU/ mL，經過保溫后，Promicol ATP系統仍然能檢測出樣品陽性，表明Promicol ATP系統具有很高的靈敏度。10-8稀釋度初始接種菌液平板獲得結果為0 CFU/mL，而接種樣品保溫后檢測結果顯示一個為陽性、一個為陰性，表明在菌液原始濃度很低時，一個樣品接種到菌株，而另一個樣品并沒有接種到菌株。這兩個樣品保溫后分別取1 mL用平板復檢，結果也對應為一個陽性、一個陰性，ATP檢測結果與傳統平板法結果一致。

3.3 自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗結果

在樣品中接種不同濃度的自然陽性分離菌，模擬實際過程中受污染的產品。每個樣品接種1 mL菌液稀釋液，每個稀釋度進行2 個樣品重復。進行ATP檢測時，每個樣品檢測4 個重復。Promicol ATP方法檢測的同時，每個樣品均取1 mL用平板法檢驗，結果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）”。檢驗結果如表4。

從表4結果可知，接種了不同濃度的自然陽性分離菌的純牛奶樣品，經過36 ℃保溫48 h后進行ATP檢測，能獲得高RLU值。其中，接種了10-6稀釋度菌液的兩個樣品說明，即使樣品中的初始菌污染水平很低（＜10 CFU/mL），經過保溫后，Promicol ATP系統仍然能檢測出樣品陽性，表明Promicol ATP系統具有很高的靈敏度。10-7稀釋度初始接種菌液平板獲得結果為0 CFU/mL，而接種樣品保溫后，兩種方法的檢測結果均為一個陽性、一個陰性，表明在菌液原始濃度很低時，一個樣品接種了低濃度菌株，而一個樣品并沒有接種到菌株。此試驗結果表明，ATP檢測結果與傳統平板法結果一致。

表3 36 ℃保溫48 h后，人工污染的純牛奶的ATP檢測值

表4 36 ℃保溫48 h后，人工污染自然陽性分離菌的UHT滅菌純牛奶的ATP檢測值

3.4 Promicol ATP系統檢測與GB 4789.26-2013商業無菌對照試驗結果

抽取UHT滅菌高鈣奶10 盒，36℃保溫48 h進行ATP檢測，另抽取同批次相同時間段的產品10 盒，按照GB 4789.26-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 商業無菌檢驗》的要求操作，記錄感官、pH值及微生物變化，檢測結果如表5。

從表5結果可知，國標法檢驗樣品感官正常，pH值與對照樣差異為0.06，無微生物增殖，符合商業無菌要求；采用Promicol ATP系統檢驗結果為合格，與國標商業無菌檢驗結果相符。

4 應用情況

當前實驗室UHT滅菌奶產品采取36 ℃保溫48 h檢驗菌落總數與36℃保溫7 天測pH值相結合，并輔以部分商業無菌檢驗的模式，在以上驗證試驗獲得預期結果的情況下，部分產品進行Promicol ATP系統快速放行，同時與當前檢驗模式對照，結果如表6。

由表6可見，Promicol ATP系統檢驗結果與傳統檢驗方法的結果一致，可以替代傳統檢驗方法用于UHT滅菌奶的快速放行。

5 結論

5.1 通過試驗驗證，使用Promicol ATP系統進行UHT滅菌奶商業無菌快速檢測，所選的試劑及程序能有效去除樣品中的非微生物ATP，并獲得低且可重復的陰性空白RLU值。

5.2 蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗及自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗結果均表明，Promicol ATP檢測方法靈敏度高，且檢測結果與平板法檢測結果一致，能檢測出日常生產中有可能污染產品的微生物。

5.3 與國標法商業無菌檢驗對照試驗結果及后續使用情況表明，Promicol ATP系統檢驗結果與GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 商業無菌檢驗》相符。

5.4 驗證過程可知，使用Promicol ATP系統對UHT滅菌奶進行檢測，約25 min可完成96 個樣品的檢測，且操作簡便，此方法可作為快速、便利的商業無菌檢驗方法。

6 展望

根據滅菌乳相關國家標準規定，UHT滅菌奶放行的微生物要求需要符合商業無菌標準，執行GB 4789.26-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 商業無菌檢驗》，該方法操作相對繁瑣，且需要對產品進行10 天的保溫再進行檢測。目前，乳品企業大多采用保溫5～7 天后，平板培養2 天的方法對產品進行等同于商業無菌的檢測。所以，越來越多的乳品企業傾向選擇可靠、穩定的微生物快速檢測方法，作為產品快速放行的快篩手段。

表5 UHT滅菌高鈣奶ATP系統檢測值與國標法檢驗結果對照

表6 ATP系統檢測值與當前實驗室檢驗對照

采用Promicol ATP微生物快速檢測系統，乳品企業對產出樣品進行36 ℃保溫48 h后快速檢測，能在2.5～3 天內實現產品放行，且結果準確、靈敏度高、操作簡便，大大提高工作效率，縮短UHT滅菌奶的檢驗時間，加強企業的市場競爭力，加速企業資金回流，對乳品企業質量控制的發展具有重要意義，在其它UHT產品（如飲料）上也有廣闊的應用前景。

[1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. GB 4789.26-2013食品微生物學檢驗，商業無菌檢驗[S]. 北京：中國標準出版社，2013.

[2] 尹子波，侯玉柱，尹建軍，等. ATP生物發光技術在微生物檢測中的應用[J]. 食品研究與開發，2012，33（2）：228-232.

[3] 王茁. ATP 熒光微生物檢測法在食品衛生監控領域中的應用與展望[J]. 中國食品衛生雜志，2004，16（3）：266-267.

[4] Luning P A，Devlieghere F，Verhe R. Safety in the agri-food chain[M].The Netherlands：Wageningen Academic Publishers，2006.

The Application of Promicol ATP Microbial Rapid Detection System in UHT Milk Commercial Sterility Test

LIN Mu-di1，HUANG Shi-yun2，YANG Ai-jun1，HE Ying1
（1 Guangdong Yantang Dairy Co.，Ltd；2 Guangzhou Sino-Lab Biotechnology Co.，Ltd）

Adenosine triphosphate（ATP）can be applied as the marker molecular to a bioluminescence microorganism rapid testing system. ATP reacts with specific patented reagents，releasing fluorescence. By testing the microbial ATP in Ultra High Temperature （UHT）milk or UHT dairy products，microbial contamination can be detected. Comparing with the traditional GB commercial sterilization method，this method is more rapid，sensitive and easy. Validation results show high consistency between the two methods，indicating that ATP bioluminescence method can be used for UHT products rapid screening and release. It implies great signif i cance in quality monitoring and control of UHT milk and dairy products.

Adenosine triphosphate（ATP）；commercial sterility test；ultra high temperature（UHT）sterilization milk；rapid testing

林木娣（1982-），女，大學本科，廣東燕塘乳業股份有限公司品控中心食品助理工程師，主管微生物檢驗和原材料驗收工作。

2017-05-15）