半枝蓮多糖對胃癌細胞SGC—7901的細胞活性影響

高山+宋高臣+許曉義

【摘要】 目的：研究半枝蓮多糖（scutellaria barbata polysaccharides，SBP）對胃癌細胞SGC-7901細胞活性的影響。方法：利用不同質量濃度半枝蓮多糖處理SGC-7901胃癌細胞，對SBP處理后的SGC-7901進行細胞計數，利用MTT法檢測半枝蓮多糖對胃癌細胞SGC-7901的細胞活性的影響；采用熒光定量RT-PCR對SGC-7901細胞中的野生型P53基因的表達進行檢測。結果：經SBP處理后胃癌細胞SGC-7901的細胞數明顯減少，SBP對SGC-7901的細胞活性的抑制呈劑量依賴性，其中20 μg/ml SBP組的活性抑制率最高，野生型P53基因表達量隨SBP質量濃度升高而增加，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達量高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。結論：半枝蓮多糖通過上調抑癌基因P53以抑制胃癌細胞SGC-7901的生長活性。

【關鍵詞】 半枝蓮多糖； 胃癌； 增殖抑制； 基因表達調控； 細胞培養

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.15.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2017）15-0001-02

Influence of Scutellaria Barbata Polysaccharide on the Cell Activity of Gastric Carcinoma Cell SGC-7901/GAO Shan，SONG Gao-chen，XU Xiao-yi.//Chinese and Foreign Medical Research，2017，15（15）：1-2

【Abstract】 Obejective：To study the effect of SBP（scutellaria barbata polysaccharides） on SGC-7901 gastric cancer cellular activity.Method：SGC-7901 gastric carcinoma cell was handled with SBP in different mass concentration，the cellular activity that SGC-7901 under the treatment of SBP was observed by MTT，the expression of wt-P53 gene was detected in SGC-7901 including which cultured by SBP.Result：The count of SGC-7901 which had been handled by SBP reduced significantly， the depression of cellular activity had dose-dependent，the most obvious depressive activity was in the 20 μg/ml SBP group，the level of wt-P53 expression in SBP cultured SGC-7901 cell group elevated with the increase of mass concentration of SBP.The level of P53 expression in the 10 and 20 μg/ml

SBP group were higher than the negative control，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：SBP depresses the growth of SGC-7901 gastric tumor cell by upregulating P53 gene.

【Key words】 Scutellaria barbata polysaccharides； Gastric cancer； Depression of proliferation； Regulation of genome expression； Cell culture

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

半枝蓮（Scutellaria barbata），作為一種民間常用中草藥，其性寒，味辛、苦，具有清熱解毒、散癖止血、利尿消腫等功效，常用于治療咽喉腫痛、跌打傷痛、療瘡腫毒、水腫、黃疽、蛇蟲咬傷等[1]。現代研究及臨床數據證明，半枝蓮具有良好的抗腫瘤活性，療效確切，主治原發性肝癌等消化道腫瘤、肺癌及宮頸癌等婦科腫瘤[2]。半枝蓮多糖（Scutellaria barbata polysaccharides，SBP）是半枝蓮中的重要多糖成分，前期研究發現其具有對化療藥物環磷酰胺的增效減毒作用以及對肝癌SMMC-7721明顯的生長抑制作用。本研究通過對半枝蓮多糖對胃癌細胞SGC-7901細胞生長活性及其對野生型P53抑癌基因影響的研究，以探索半枝蓮多糖對胃癌細胞的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SGC-7901胃癌細胞株（中國科學院上海細胞所細胞庫），RPMI 1640培養基（Hyclone）；FBS胎牛血清（solar bio）；胰酶（solar bio）；噻唑藍（MTT，Sigma）；DMSO（Sigma）；96孔細胞培養板；半枝蓮粗多糖（黑龍江中醫藥大學生化教研室制備）；總RNA提取試劑盒（ThermoFisher）；Taq DNA Polymerase（合生基因）；SYBR ExScriptYMRT-PCR Kit（中國Gene Pharma 公司）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。

1.2 方法

1.2.1 半枝蓮多糖的制備 取半枝蓮粗多糖干燥粉末按照1∶4的比例在45 ℃溫水中浸提2 h。加入4倍體積95%乙醇攪拌，室溫靜置6 h，離心（12000 rpm，15 min）收集沉淀；沉淀經乙醚去脂、氨水脫色、三氯乙酸法脫蛋白，重復實驗并以硫酸-苯酚法跟蹤檢測，保證多糖含量在90%以上。將沉淀用蒸餾水溶解，在液氮中冷凍8 h后取出，用凍干機冷凍48 h，取出凍干粉，將凍干粉溶于適量蒸餾水中，用無菌濾膜過濾器過濾除菌兩次，收集濾液并計算濃度，過濾過程采用無菌操作。

1.2.2 細胞培養 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養SGC-7901胃癌細胞株，在37 ℃、5%CO2環境下的細胞培養箱中進行傳代。取呈對數生長的細胞用于實驗。

1.2.3 半枝蓮多糖對細胞生長的影響 將對數生長的SGC-7901胃癌細胞用胰酶（EDTA）消化后制備細胞懸液，并將其以每孔細胞濃度為5×103個接種于96孔細胞培養板中，培養24 h使細胞充分貼壁。種板后在已接種的孔內加入不同濃度的半枝蓮多糖（SBP）溶液，并使孔中藥物質量濃度分別達到20、10、5、2.5 μg/ml，RPMI-1640培養基為陰性對照組，每組設5個復孔，在培養箱培養48 h，后進行細胞計數。經MTT法處理后[3]，在490 nm波長處測定吸光度，計算不同質量濃度的半枝蓮多糖對SGC-7901的生長抑制率：p抑制（%）=（1-D藥物組/D對照組）×100%。式中：D為樣品在490 nm波長下的吸光度。

1.2.4 胃癌細胞中P53基因的表達 將對數生長的SGC-7901細胞懸液以細胞濃度5×106個/ml分別加入5個培養瓶中，以藥物質量濃度為0、2.5、5、10、20 μg/ml分別加入各個培養瓶中，置于培養箱中培養5 d。用總RNA提取試劑盒提取RNA。取1 μg總RNA進行熒光定量RT-PCR擴增P53基因。P53上游引物：TGTGGAGTATTTGGATGACA，下游引物：GAACATGAGTTTTTTATGGC；內參基因β-actin上游引物：GAGACCTTCAACACCCAGCC，下游引物：GCGGGGCATCGGAACCGCTCA。反應體系為25 μl，反應條件：42 ℃反轉錄1 h，94.0 ℃預變性5 min，94.0 ℃變性45 s，55.0 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸2 min，80.0 ℃收集熒光30 s，共35個循環。根據CT值分析P53基因的表達[4]。

1.3 統計學處理

選用SPSS 13.0統計軟件進行實驗結果分析，計量資料以（x±s）表示，比較用單因素方差分析，P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組藥物質量濃度對SGC-7901生長的影響

細胞個數隨藥物質量濃度升高而遞減，見圖1。各SBP組細胞在490 nm波長的吸光度均明顯低于陰性對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），質量濃度20 μg/ml的半枝蓮多糖對胃癌細胞SGC-7901抑制作用最強，見表1。

2.2 半枝蓮多糖干預后的SGC-7901胃癌細胞P53基因的表達

熒光定量RT-PCR結果表明，半枝蓮多糖對抑癌基因P53的表達具有明顯的上調作用，其表達量隨藥物質量濃度升高而增加，與陰性對照組相比，各劑量組的上調倍數分別為1.06、1.31、1.08、2.06倍，其中，在20 μg/ml SBP組中P53上調結果最為明顯，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達量高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.01），見表2、圖2。

3 討論

胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病因素廣泛且機制復雜，臨床上多采用外科手術與放化療聯合的方法進行治療，但是創傷大、復發率高等諸多不足仍然是困擾醫學工作者的難題[5]。中藥多糖作為中草藥的有效成分之一在近年來也是國內的研究熱點，眾多研究表明中藥多糖對胃癌細胞的生成、轉移、凋亡等諸多階段有不同的作用，韓澄等[6]發現青錢柳多糖能抑制胃癌MGC803細胞生長，并促使其凋亡；吉愛軍等發現樹舌多糖通過抑制胃癌細胞SGC-7901中的Cyclin D1、P16的表達來發揮其對腫瘤細胞的抑制作用[7]。

P53基因是一種重要的抑癌基因，分為野生型和突變型，野生型即正常的P53基因（wt-P53），主要通過產生P53蛋白來調控細胞的增值過程以防止細胞發生癌變[8]。P53與多數靶基因的表達有關，并影響腫瘤細胞周期、分化、轉移、凋亡、DNA損傷等諸多作用[9]。

本研究結果表明：胃癌細胞SGC-7901在半枝蓮多糖的作用下細胞數目減少，在細胞活性方面，不同質量濃度的半枝蓮多糖均可抑制SGC-7901的細胞活性，并隨計量增大而活性降低。在基因水平的研究中，不同質量濃度的半枝蓮多糖干預后的SGC-7901細胞，其野生型P53基因的表達量隨藥物質量濃度的升高而增加，其中，在20 μg/ml半枝蓮多糖干預下的SCG-7901細胞P53基因表達量是無藥物干預時的2.06倍，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達量高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。綜上所述，半枝蓮多糖能抑制胃癌細胞SCG-7901的增殖，其機制可能與上調P53基因表達有關。

參考文獻

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