致病菌與糖的特異性識別及其分析應用研究

崔飛云,徐 溢,趙 斌,車玉蘭，劉露露

(1.重慶大學 化學化工學院，重慶 400044；2.重慶大學 光電工程學院微系統研究中心，重慶 400044；3.重慶大學 新型微納器件與系統技術國防重點學科實驗室，重慶 400044；4.重慶大學 微納系統及新材料技術國際研發中心，重慶 400044)

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綜 述

致病菌與糖的特異性識別及其分析應用研究

崔飛云1,3,4,徐 溢1,2,3,4*,趙 斌1,3,4,車玉蘭1,3,4，劉露露1,3,4

(1.重慶大學 化學化工學院，重慶 400044；2.重慶大學 光電工程學院微系統研究中心，重慶 400044；3.重慶大學 新型微納器件與系統技術國防重點學科實驗室，重慶 400044；4.重慶大學 微納系統及新材料技術國際研發中心，重慶 400044)

致病菌往往通過凝集素-糖特異性識別來實現對宿主細胞的粘附，進而感染宿主組織，引起病變。 因此，研究致病菌與糖的特異性識別有利于進一步了解感染性疾病的致病機制，為致病菌的特異性檢測和感染性疾病的治療提供新的策略。該文總結了致病菌-糖特異性識別的相關機制機理；介紹了目前主要的研究方法和技術，特別評述了熒光光譜、表面等離子體共振、電化學阻抗譜及石英晶體微天平等技術在該研究中的應用現狀，并對這4種技術與微流控芯片平臺的結合進行了探討；針對致病菌檢測特異性差、耐藥性嚴重等難題，重點綜述了致病菌-糖的特異性識別在細菌分離、富集、檢測、鑒別、生物膜抑制及抗菌糖類藥物篩選方面的應用。最后對致病菌-糖特異性識別基礎和應用研究進行了展望。

糖-凝集素相互作用；多效價相互作用；細菌粘附；細菌檢測；綜述

糖類是生物體進行新陳代謝所需能量的主要來源，同時，它還調節著一系列生命活動，具有重要的生物學功能[1]。糖的生物學功能主要是通過與蛋白質發生特異性識別來實現。可特異性識別糖的蛋白質主要包括單克隆抗體、酶、糖轉運蛋白和凝集素[2]。其中，糖-凝集素特異性識別相關的生理學及病理學過程有致病菌或病毒感染、細胞信號傳導、細胞凋亡、受精、癌癥轉移以及免疫調節等[3]。致病菌感染研究在感染性疾病治療和細菌特異性檢測方面具有重要的意義。所以，本文重點綜述了致病菌表面凝集素與宿主細胞表面聚糖特異性識別相關的機制機理、分析檢測技術和實際應用，并結合本課題組的工作特色[4-5]，著重總結其在細菌檢測方面的最新應用進展。最后對致病菌-糖特異性識別基礎與應用研究進行展望。

1 致病菌-糖特異性識別的相關機制

1.1 致病菌的粘附機制

圖1 細菌粘附過程原理示意圖Fig.1 The principle of bacterial adhesion as a prelude to infection

細菌粘附是細菌感染人畜的先決條件，它受到多種理化因素和生物因素的制約，是多種粘附素和受體共同作用的結果，具有宿主特異性、組織特異性和細胞特異性[6-7]。作為毒力因子之一的菌毛，一般會參與致病菌對宿主細胞的特異性粘附過程[8]，其主要途徑是多個菌毛凝集素與宿主細胞表面多個聚糖發生特異性相互作用(圖1)。

與細菌凝集素特異性結合的聚糖(Glycan)是宿主細胞膜表面糖復合物的糖基部分。聚糖一般分為3大類：連接脂質的聚糖、通過氮原子與蛋白質連接的聚糖(N-連接聚糖)以及通過氧原子與蛋白質連接的聚糖(O-連接聚糖)。聚糖中最常見的組分是己糖。正常情況下，己糖通過5-羥基與1-醛基反應形成半縮醛，以六元環吡喃糖構型形式出現。聚糖中常出現的己糖包括D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、D-甘露糖(Man)、N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰-D-葡糖胺(GalNAc)等。此外，還有其他一些單糖，如葡糖醛酸(GlcA)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)和N-乙酰神經氨酸(NeuAc)。

圖2 銅綠假單胞菌粘附人體肺部上皮細胞過程示意圖 [9]Fig.2 Schematic description of adhesion and lung infection by P.aeruginosa[9]

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱綠膿桿菌，是目前研究較多的一種革蘭氏陰性菌，會引起菌血癥、慢性肺部感染、尿道感染以及急性潰瘍性角膜炎等多種疾病。該菌表面有兩種凝集素LecA(PA-IL)和LecB(PA-IIL)，它們均為四聚物單體。LecA主要與人體肺部上皮細胞表面糖脂的α-Gal殘基特異性結合，LecB則與多種組織上皮細胞表面的巖藻糖基、甘露糖基以及路易斯酸結合[9]。通過這兩類特異性結合，銅綠假單胞菌粘附到宿主細胞表面，進而感染細胞和組織，引發病變(圖2)。

微需氧型的革蘭氏陰性菌幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)能引起胃炎、胃潰瘍以及胃癌。目前發現，其表面具有BabA(特異性識別Lewis b)、LabA(特異性識別N,N-二乙酰基氨基乳糖苷，LacdiNAc)和SabA(即H-1型，特異性識別唾液酸化的Lewis a和Lewis x) 3種凝集素[8,10-12]。這3種凝集素-糖相互作用介導了H.pylori對胃粘膜的粘附。Magalh?es等[13]證明了缺乏巖藻糖轉移酶的小鼠受H.pylori侵染的幾率大大降低，其原因是巖藻糖轉移酶的缺失導致了BabA特異性識別的Lewis a和Lewis x生物合成受阻。

革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)是常見的腸道、尿道致病菌，其粘附過程主要由菌毛凝集素與腸道上皮細胞表面聚糖的特異性相互作用來介導。大腸桿菌菌毛凝集素主要分為1型、P型、S型及F1C型[14]。在1型菌毛末端，具有可與α-Man特異性識別的FimH凝集素。在P型菌毛上，具有與Galα1-4Gal(Galabiose)特異性識別的PapG凝集素。具有P型菌毛的大腸桿菌，如E.coliO157∶H7能引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥，甚至死亡。S型和F1C型凝集素分別與唾液酸化的半乳糖和GalNAcβ1-4Gal發生特異性識別。正是由于這些菌毛凝集素的存在，才使大腸桿菌特異性粘附人體的不同組織，從而引發不同程度的疾病。

以上3種致病菌均為革蘭氏陰性菌，也有研究發現，一些革蘭氏陽性菌也可通過其表面的凝集素來粘附宿主細胞，如豬鏈球菌(Streptococcussuis)通過識別半乳二糖來粘附豬的肺組織、腦組織等，從而引發腦膜炎、敗血癥及肺部感染。 表1總結了文獻[15-17]中細菌凝集素-糖特異性作用的例子。

表1 以糖為識別受體的致病菌[15-17]

1.2 凝集素-糖的特異性識別機制

從分子水平來看，致病菌與糖的特異性識別實質為凝集素與糖的相互作用。凝集素與糖之間的相互作用包括氫鍵、金屬配位鍵、范德華力和疏水性作用力等。有研究指出，糖分子上的 CH 基團與凝集素分子中芳環類殘基之間的 CH- π 作用也扮演著重要角色[18]。

圖3 凝集素-糖結合方式示意圖Fig.3 Contact points between carbohydrate and lectin

由于糖分子具有多個羥基，凝集素分子存在多個氨基和羧基，所以氫鍵廣泛存在。Ca2+，Mn2+等二價陽離子通過形成配位健來直接或間接地參與糖與凝集素的相互作用過程。例如，伴刀豆凝集素ConA(與α-D-甘露糖和α-D-葡萄糖發生特異性識別)的單體含有1個過渡金屬離子結合位點S1(一般為Mn2+)，1個Ca2+結合位點S2以及1個糖類結合位點[19]。P.aeruginosa表面的凝集素PA-IL和PA-IIL也需要在Ca2+調節下分別與Gal和Fuc特異性識別[20]。除了以上兩種與親水性相關的作用力外，疏水作用力在糖-凝集素識別中起著重要的作用，如Gal與凝集素的芳香烴殘基之間的作用(圖3)。

為了在分子水平上深入理解凝集素-糖相互作用，越來越多的學者從晶體結構學的角度來闡明其結合機制。Hung等[21]從晶體結構學的角度解釋了大腸桿菌凝集素FimH與D-甘露糖的相互作用，分析結果表明，FimH表面的糖結合域可與單糖Man完美緊密的結合。甘露三糖與甘露戊糖等寡糖與它的結合親和力之所以增強，是多余糖鏈的疏水面與FimH的“疏水脊”重疊的結果。在糖鏈上修飾上其它疏水性基團(如苯環)也可以增加其結合親和力。沙門氏菌1型菌毛凝集素也可與Man特異性識別，但甘露寡糖或疏水基團修飾的甘露糖并不能增加其結合親和力，可能是因為其凝集素表面不具有“疏水脊”區域[22]。

1.3 多效價相互作用機制

一個粒子(小分子、寡糖、蛋白質、核酸或一些分子的集合體、細胞膜、細胞器、病毒、細菌或細胞)與其它粒子相互作用時，獨立結合點的個數稱為效價(Valent)[23-24]。凝集素與糖單效價相互作用的結合親和常數Ka一般為103～104L/mol，多效價相互作用的結合親和常數Ka一般大于106L/mol[25-26]。生物體中，一般由多個糖配體與多個凝集素受體或一個凝集素的多個結合域進行結合，通過這種多效價相互作用的方式增加結合親和力和結合特異性，這種效應稱為“多效價效應”或“簇集效應”[27-28]。例如：流感病毒與單個唾液酸結合的Kd在mmol/L數量級，然而在生理條件下流感病毒與宿主細胞受體(唾液酸)的Kd卻達到nmol/L數量級[29]，這是多效價相互作用的結果。

圖4 受體-配體單多效價相互作用的模式圖Fig.4 Mechanisms diagram of interaction between multivalent ligands and multivalent receptors

在致病菌-糖特異性識別的過程中，一個致病菌往往由多個菌毛同時參與粘附，同一個菌毛上的凝集素往往會與多個糖配體進行結合，以增加結合親和力和結合特異性[15,30]。正是由于多個糖-凝集素的單效價相互作用同時發生，才表現出整體較強的多效價相互作用，但多效價相互作用不等于單效價相互作用的疊加。 研究表明，多效價相互作用的機制比較復雜，其主要有4種結合模式(圖4)，即螯合結合(Chelate binding)、受體簇集結合(Receptor clustering)、亞位點結合(Subsite binding)以及統計學上的重新結合(Statistical reassociation)[31]。不同的相互作用模式產生不同的生物響應。螯合結合模式是指1個同源多聚體凝集素的n個結合位點同時與1個多糖基分子的m個配體發生相互作用。這種結合模式可以大大增強受體-配體之間的結合親和力。Zhu等[32]在研究E.coli與Man的相互作用時，揭示了E.coliORN178可同時與10～11個Man分子通過螯合結合模式發生多效價相互作用，與之前文獻提到的通過亞位點結合模式提高結合親和力不同。受體簇集模式是指當多效價的配體存在時，細胞膜表面的單效價受體通過在脂質雙分子層中的擴散作用聚集，使其發生多效價相互作用。亞位點結合模式是指1個非均勻二效價配體與單效價受體結合后，其另外1個亞識別位點與受體以不同的結合親和力和特異性發生的相互作用，亞單位相互作用力主要為疏水作用力，一般特異性很弱。統計學意義上重新結合概率大的模式主要是指，一個配體周圍有高密度的受體，一旦一個受體與配體解離，則周圍其它的受體會很快會再與配體結合，維持了受體-配體動態的結合，從而增加了結合親和力。

2 致病菌-糖特異性識別的研究方法與技術

目前，研究凝集素-糖或細菌-糖特異性識別的方法和技術有很多，高分辨率核磁共振、X射線晶體衍射和計算機分子模擬技術通常用來研究凝集素-糖特異性結合的分子機制[2]；親和色譜、親和毛細管電泳、等溫滴定量熱是經典的檢測生物分子之間相互作用的方法，通常用來計算細菌/凝集素-糖結合親和力[26]；質譜、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦成像、紫外-可見光譜、熒光光譜、循環伏安法、方波伏安法和差分脈沖伏安法等主要用于以糖為識別受體的細菌檢測研究。

近年來，基于熒光光譜、表面等離子體共振、石英晶體微天平和電化學阻抗等檢測技術的生物傳感在研究細菌/凝集素-糖特異性識別方面展現出優異的性能，它們既可用來計算細菌/凝集素-糖結合親和力常數，也可應用到細菌檢測、糖類抗粘附藥物篩選等研究領域，得到研究者的廣泛關注，且該類生物傳感與微陣列芯片、微流控芯片結合的研究更是該領域的前沿與熱點。

2.1 熒光光譜

熒光光譜是研究生物分子相互作用的重要手段。在溶液體系中，利用熒光光譜研究細菌-糖的特異性識別主要采用熒光競爭性結合試驗(Fluorescence competition binding assay)或熒光猝滅試驗。Abdelhamid等[33]將殼聚糖(Chitosan)固定在CdS QDs上，得到CdS@CTS，并選擇能與殼聚糖特異性識別的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌作為CdS@CTS的猝滅劑。當CdS@CTS與細菌結合后，其熒光強度降低，基于熒光強度的變化值，利用Stern-Volmer方程計算得到CdS@CTS與兩種細菌的結合常數均在105數量級。

糖芯片(Carbohydrate microarray)是將多個不同的糖分子通過共價或非共價方式固定在基質(玻璃、硅片等)上，進而對凝集素或細菌等待測樣品進行測試、分析的手段，其檢測技術一般為熒光光譜[34]。糖芯片最鮮明的特征是樣品用量少和通量高。Gade等[35]將Man和Fuc修飾的β-環糊精-二茂鐵化合物固定在玻璃上，用于E.coliORN 178和P.aeruginosa檢測。Flannery等[36]評述了糖芯片用于探索細菌-糖相互作用的現狀，并指出糖芯片是目前未充分利用但獲得較大關注的一種檢測技術，它在細菌種類鑒別、細菌感染治療方面將得到更廣闊的應用。

當然，糖芯片存在一定的局限。一方面，糖芯片表面固定的糖分子缺乏移動性，而這種移動性對于細菌與糖的多效價相互作用至關重要。在細胞表面，糖一般以糖脂或糖蛋白的形式存在，它們所處的環境是可以移動的脂質雙分子層；另一方面，在基質表面糖的固定密度難以控制。而糖的固定密度決定了細菌-糖之間發生單效價相互作用還是多效價相互作用。針對這兩個問題，Zhu等[32]將含有甘露糖的微小單層囊泡(Small unilamellar vesicle，SUV)固定在修飾有膽固醇-聚乙二醇(cholesteryl-PEG)的玻璃基底上，形成支撐脂質雙分子層(Supported lipid bilayers，SLBs)。通過該方法制備的糖芯片充分模擬了細胞表面的微環境，使得Man具有移動性，同時，可以通過控制SUV中Man的量來控制Man在SLBs上的密度。將E.coliORN178在該糖芯片上進行粘附實驗，利用顯微鏡觀察Man不同密度區域細菌粘附的數量，然后利用Langmuir等溫吸附模型計算它們的解離常數，當Man的界面密度θM=0.2 nm-2時，E.coliORN178與Man的單效價親和結合常數為KD1=(1.0±0.2)×10-22mol/L，多效價親和結合常數KD2=(1.3±0.3)×10-27mol/L，此時多效價相互作用占主導；當Man的界面密度θM=0.02 nm-2時，E.coliORN178與Man的單效價親和結合常數為KD1=1.0×10-21mol/L，多效價親和結合常數KD2=5.2×10-17mol/L，此時單效價相互作用占主導。由此，揭示了一種新的E.coli粘附機制，即隨著可移動性Man密度的增加，凝集素FimH與Man的相互作用由單效價轉變為多效價，這種多效價相互作用進一步激發了E.coli的多菌毛粘附，顯著增強了它們之間的結合力。

2.2 表面等離子體共振

表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)是一種可以實時跟蹤生物分子相互作用的光學檢測技術，其優點是響應快、免標記。首先，將糖共價鍵合在金膜表面構建生物傳感界面，然后將凝集素、細菌等分析物溶液以恒定流速流過傳感界面，當兩者發生親和作用時，會引起生物傳感界面上質量增加，從而導致界面折射率變化，并通過共振角信號的改變來顯示。反射率的變化(RI)與結合在金屬表面的生物大分子質量成正相關，1 000 RU的變化表示傳感界面上1 ng/mm2的質量變化[37-38]。目前，利用該方法研究糖-凝集素結合親和力的較多[39-41]，而用來研究糖-細菌結合親和力的較少。Bulard等[42]在金表面固定了巖藻糖(Fuc)、唾液酸(Neu5Ac)等7種糖，利用SPR來檢測這7種糖與大腸桿菌不同血清型K-12/O157∶H7/O157∶H7-/O55∶H7/O145∶H28-相互作用力的大小，依據親和力大小差異鑒別出E.coliO157∶H7，E.coliO157∶H7-和E.coliO145∶H28-這3種不同的菌株。

表面等離子體共振成像(SPR imaging)利用電荷耦合器件(Charge coupled device，CCD)記錄樣品反射光的圖像，從而進行生物分子相互作用的動態或靜態分析[43]。Smith等[44]以SPRi為檢測技術，并依據弗魯姆基等溫吸附方程(Frumkin isotherm)，計算了凝集素jacalin在Gal界面上的吸附系數KADS=(2.2±0.8)×107L/mol和凝集素ConA在Man界面上的吸附系數KADS=(5.6±1.7)×106L/mol。與SPR相比，SPRi最大的優勢是易于與微陣列芯片結合，可以實現大量無需標記樣品的原位、實時檢測。

2.3 電化學阻抗譜

電化學阻抗譜(Electrochemical impedance spectroscopy，EIS)技術可以通過測量多個參數對電極表面生物分子間的相互作用過程和動力學機制加以分析。在檢測凝集素-糖相互作用方面,EIS展現出較高的靈敏度，Tkac等[45]利用阻抗糖生物傳感檢測流感病毒血凝素，檢測限可達amol/L數量級。此外，阻抗檢測具有無需標記的優點，且越來越多的研究表明，基于阻抗檢測的生物傳感器件更易實現自動化、便攜化及高通量檢測。在國內，鞠熀先課題組和朱俊杰課題組在該領域做了很出色的工作[46-48]。他們將不同的凝集素固定在電極表面，用EIS來檢測癌細胞表面糖基的動態表達。近年來，EIS開始應用到細菌-糖特異性識別相關的研究中。Guo等[49]將巰基化的甘露糖分子通過自組裝單分子層(SAMs)的方式固定在金電極表面，用電化學阻抗譜法來特異性檢測E.coliORN 178(特異性表達野生1型菌毛)，檢測限為102CFU/mL，但其構建的甘露糖傳感界面在含有0.1 mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS(pH 7.2)檢測液中5 h甚至2 d才能達到穩定狀態，耗時過長，易使傳感界面失去生物活性，所以，糖傳感界面的研究有待深入，電化學阻抗檢測液有待優化。

由于電分析元件可以與微加工技術(MEMS)和微流控芯片平臺很好地融合，這使得它易于制備經濟的現場檢測器件(POCT)[50-53]。La Belle等[54]制備了集成微電極的微流控芯片，利用電化學阻抗法檢測糖-凝集素的相互作用，取得了良好效果。在微流控芯片檢測單元中，待檢測樣品具有流動性的特點，可以更加有效地模擬生理條件，且能縮短檢測時間。因此，將基于阻抗檢測的糖生物傳感與微流控芯片相結合，有望成為分析細菌-糖相互作用的有力工具。

2.4 石英晶體微天平

石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance，QCM)是一種可檢測傳感器表面吸附物質質量變化的技術。在液相環境下，QCM 在測定生物樣品如蛋白質、核酸、病毒、細菌及細胞等方面具有特色，測定共振頻率比較容易達到較高的精確度，目前已有在細菌-糖特異性識別中的應用研究。Wang等[55]利用QCM研究了銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1和大腸桿菌E.coliK-12與4種含有半乳糖(Gal)的高分子聚合物的相互作用，結果表明含有C-型凝集素的PaeruginosaPAO1在Ca2+的調節下可以與含有Gal的高分子較好的特異性識別。該課題組又在基于石英晶體微天平的生物傳感界面上固定了葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)及疏水性分子功能化的聚N-異丙基丙烯酰胺，通過檢測P.aeruginosaPAO1與不同界面之間的相互作用，證明了凝集素與糖的特異性相互作用在銅綠假單胞菌對宿主細胞粘附過程中起主導作用[56]。Ma等[57]在金電極表面設計了甘露糖(Man)和甘露糖-凝集素ConA(Man/ConA)兩種可以特異性檢測細菌的傳感界面，通過QCM檢測E.coliW1485，檢測限分別為1.7×104CFU/mL和50 CFU/mL。但QCM不易實現多組分檢測，且非特異性吸附干擾嚴重，因此干擾信號的消除有待進一步解決。

3 致病菌-糖特異性識別的應用研究進展

3.1 細菌的分離與富集

細菌表面凝集素與糖具有較強的特異性識別親和力，所以利用糖基修飾的磁性納米粒子對細菌進行分離富集有可能得到更佳的效果。El-Boubbou等[58]首次將Man和Gal修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米粒子用于E.coliORN178的分離。Hatch等[59]比較了幾種糖復合物修飾的磁珠與商業化多克隆抗體修飾的磁珠對污水中大腸桿菌的分離效率，發現糖復合物修飾的磁珠具有更好的選擇特異性和分離效果。Behra等[60]制備了Man修飾的多孔聚乙二醇(PEG)磁性微球，該微球可以選擇性結合溶液中特定的大腸桿菌菌株。由于PEG具有親水性，大大降低了該磁性微球與細菌的疏水相互作用，提高了結合特異性。另外，多孔磁性微球的捕獲效率比無孔磁性微球大3～4倍，當細菌與該磁性微球的濃度比小于30∶1時，捕獲效率可達70%。

3.2 細菌的檢測與鑒別

在細菌檢測中，選擇穩定性好、識別親和力高、易于固定在傳感界面上或納米粒子表面的特異性識別受體成為一大研究熱點[61-64]。細菌特異性識別受體主要有抗體(Abs)[65]、抗菌肽(AMPs)[66]、核酸適配體[67]、凝集素[68]、噬菌體[69]和分子印跡聚合物(MIP)[70]等。本課題組前期采用抗體檢測了沙門氏菌[71]。首先將第一抗體固定在微流控芯片的檢測區用于對沙門氏菌的捕獲，然后加入修飾有第二抗體的量子點，利用熒光法得到檢測限為37 CFU/mL。同時，本課題組設計并制備了碳量子點-適配體復合物納米粒子，利用適配體對鼠傷寒沙門氏菌進行檢測[72]，檢測限達到50 CFU/mL。然而，抗體存在對pH值和溫度的要求較高、不能區別死活細菌以及成本高等缺點；而適配體易被核酸酶降解，所以需尋找新的細菌檢測特異性識別受體。

由于致病菌表面凝集素與糖可以特異性識別，且它們之間多效價相互作用的親和力很高，所以糖成了細菌檢測領域很有開發潛力的特異性識別受體。與抗體相比，糖分子不會在溫度和pH值改變的情況下因變性而失去活性，且糖分子較抗體分子小，有利于在傳感界面上高密度固定，促進多效價識別，增加特異性識別親和力，進而提高細菌檢測靈敏度。Nilsson等[73]首次嘗試以二糖Galα1-4Galβ作為生物傳感器的識別元件，用來檢測大腸桿菌(表達P型菌毛),實驗得到S/N=75，充分證明了糖分子可以作為細菌特異性檢測的識別受體。Jelinek等[74]在早期綜述了糖生物傳感器(Carbohydrate biosensors)用于致病菌檢測的原理及應用，但其綜述的內容主要集中在致病菌與糖或糖納米粒子相互作用的研究，真正用于致病菌檢測的較少，針對大腸桿菌的檢測研究檢測限均在104CFU/mL以上。Guo等[49]通過自組裝單分子層(SAMs)的方式，將巰基化的甘露糖分子固定在金電極表面，用電化學阻抗法來特異性檢測E.coliORN 178(特異性表達野生1型菌毛)，檢測限達到102CFU/mL。Ma等[57]將Man通過苯酚-聚噻吩連接鏈分子共價固定在金表面，通過Man與ConA的相互作用將ConA固定在界面上，得到了SM/TQ/Man/ConA傳感界面，以方波伏安法為檢測方法,E.coliW1485的檢測限達25 CFU/mL。Yazgan等[75]在Man上修飾了苯基，采用表面等離子體共振生物傳感器(SPR Biosensors)，對E.coliATCC25922的檢測限低至2.5 CFU/mL，這標志著以糖為識別受體的生物傳感體系可以獲得與抗體或適配體相當甚至更低的細菌檢測靈敏度。表2總結了1994～2015年以糖為識別受體檢測致病菌的相關文獻。

表2 以糖為識別受體的細菌檢測

(續表2)

GlycanreceptorPathogenDetectiontechnologyLinearityrangeCFU/mLLODCFU/mLReferenceMan-ConA7 5×102～7 5×1077 5×102Man-CdSquantumdotsE coliORN178E coliORN208CLSM104[85]Man-Poly(amidoamine)sE coliBL21CLSM102[86]Man/GalE coliORN178E coliORN208EIS1 2×102～2 5×103102[49]p?ThiolphenylaminomannoseE coli25922SPR/CV2 5～1 25×1052 5[75]Lewisa/b-NanoparticlesH pyloriJ99H pylori26695CLMS[87]ManE coliDH5αE coliHB101SWV6×102[88]ManE coliW1485QCM5×104～5×1071 7×104[57]SWV2 0×103～1 0×1048 0×102Man-ConAE coliW1485QCM2 5×102～2 5×10850SWV1 0×102～5 0×10325

圖5 MGNP3(Man)和MGNP4(Gal)鑒別3種E.coli 菌株的結果圖[59]Fig.5 E.coli strain differentiation by MGNP3(Man) and MGNP4(Gal)[59]

在二維空間和三維空間上增加糖密度，可增加有效結合位點，增大發生多效價相互作用的幾率，是提高糖生物傳感檢測靈敏度的主要途徑。Wang等[89]系統綜述了金屬納米材料、碳納米材料、量子點、磁性納米材料及硅納米材料等在糖生物傳感構建中的功能，并介紹了其在細菌檢測方面的應用。用糖作為識別受體來檢測細菌的主要挑戰之一是糖具有交叉特異性(Cross-specificity)或稱為廣譜特異性(Broad-specificity)，如Man既可與表達1型菌毛的大腸桿菌特異性識別，又可與鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌特異性識別，從而影響了糖生物傳感檢測細菌的特異性。因此，還需要科研工作者進一步發掘與單一細菌特異性識別的糖鏈。化學合成法可以根據需要在糖鏈上修飾其它功能性基團，使得糖的特異性增強。另外，通過定性檢測不同致病菌或同一致病菌不同菌株亞型與幾種不同糖受體的結合親和力的大小，可以鑒別不同的細菌菌株[90-91]。El-Boubbou等[58]根據Man磁性糖納米粒子和Gal磁性納米粒子對E.coliORN178/ORN208/ES 3種菌株的不同捕獲率鑒別了這3種菌株，其結果如圖5所示。細菌-糖特異性識別的定量研究，將進一步推動糖識別配體對細菌特異性檢測和鑒別的研究進程。

3.3 細菌生物膜形成的抑制

細菌生物膜(Bacterial biofilm)是附著在生物惰性或活性材料表面上的微生物群體。當細菌處于生物膜狀態時，內部的細菌能夠逃避抗生素或機體免疫系統的作用，造成機體持續性感染或免疫性疾病，嚴重威脅人類健康，同時，造成了巨大的經濟損失[92-93]。

圖6 糖納米粒子抑制細菌生物膜原理示意圖Fig.6 Schematic representation of ND-mannose ability to inhibit of biofilm formation

最近研究表明，糖納米粒子可以通過抑制細菌粘附來擾亂生物膜的形成(圖6)。Barras等[94]和Khanal等[95]分別合成了Man修飾的金剛石納米粒子ND-Man和ND-Man3，利用吸光度法測試其對E.coli在96孔板聚氯乙烯(PVC)表面上培養24 h后生物膜形成狀況的影響。結果表明，當ND-Man的濃度為80 μmol/L，ND-Man3的濃度為21 μmol/L時，可以顯著抑制E.coil生物膜的形成。這可能是由于糖納米粒子阻止了菌毛FimH粘附蛋白對PVC的粘附。將細菌先在96孔板上培養24 h，待生物膜形成后，再加入該糖納米粒子，則不再影響細菌生物膜的狀態。

P.aeruginosa生物膜的形成與其表面的凝聚素LecA和LecB相關。Johansson等[96]篩選出2種針對LecB的巖藻糖多肽樹枝狀大分子FD2(C-Fuc-LysProLeu)4(LysPheLysIle)2LysHisIleNH2和PA8(OFuc -LysAlaAsp)4(LysSerGlyAla)2LysHisIleNH2，其中FD2 可以有效抑制P.aeruginosa生物膜的形成(IC50=10 μmol/L)，并有效驅散已經形成的生物膜。這說明LecB的多效價糖類抑制劑可以作為抑制和驅散生物膜的有效試劑。Reymond課題組制備了多種半乳糖苷修飾的多肽樹枝狀大分子，通過抑制LecA來抑制或驅散P.aeruginosa生物膜[97-99]，發現多效價的糖配體對于生物膜形成抑制至關重要。Boukerb等[9]制備了四效價的半乳糖苷(Gal)和巖藻糖苷(Fuc)修飾的芳烴硼酸大分子，并利用吸光度法檢測其對P.aeruginosa在96孔板上培養24 h后生物膜形成狀況的影響，發現當其濃度為5 mmol/L時，能明顯減少P.aeruginosaPAO1生物膜的形成，而單效價的βGalOMe和αFucOMe對生物膜的形成無顯著影響。對照組實驗中，四效價甘露糖苷和葡糖糖苷卻不能有效抑制生物膜形成，表明糖苷抑制細菌生物膜形成具有特異性。多效價糖簇之所以能抑制生物膜的形成，可能是由于細菌表面的凝集素參與或能促進生物膜的形成，但具體的參與機制以及多效價糖簇抑制生物膜生成的機制尚需進一步研究。

3.4 糖類抗菌藥物的篩選

致病菌對傳統抗生素的耐藥性日益增強，所以研發新的作用模式或針對細菌新靶點的抗菌藥物具有巨大意義。天然多糖、糖聚合物、糖簇、糖樹枝狀大分子及糖納米粒子等可以通過抑制細菌的粘附來預防和治療細菌感染性疾病，具有取代抗生素的潛能[100]。體外及動物實驗表明，能特異性識別細菌菌毛凝集素的可溶性多糖可以阻止相應細菌對哺乳動物細胞的粘附，且糖類抗粘附藥物并不是殺死細菌，這使得細菌的突變速度減慢，耐藥性降低[101]。所以糖類抗粘附藥物在感染性疾病治療方面展現出光明的前景。

擬糖物(Glycomimetic)是人工合成的多效價糖化合物分子，與天然聚糖相比，具有代謝穩定性。同時，它可與致病菌凝集素發生高選擇性、高親和力的特異性識別，是抗粘附藥物篩選的重要對象[102]。擬糖物包括糖樹枝狀大分子、糖復合物、糖聚合物和糖納米粒子等，其設計與合成需要考慮的因素有糖的密度、糖的空間排列、支架、連接鏈以及均勻多效價還是非均勻多效價等。關于這方面的內容，已有相關綜述報道[103-104]。

針對E.coli引起的尿道感染性疾病，Appeldoorn等[105]合成了系列多效價的甘露糖化合物，測試了其抗粘附特性，為抗粘附藥物的研究提供了基礎。Hartmann等[106]合成5種帶有不同官能團的甘露糖苷，檢測了它們對E.coliPKL1162粘附哺乳動物結腸細胞的影響，結果顯示修飾有苯環和β-內酰胺環的甘露糖苷具有優異的抗粘附特性且細胞毒性很低。Chaudhary等[107]制備了一系列不同形貌的糖基化金納米粒子并檢測它們的抗粘附和抗感染性能，結果表明，甘露糖基化的金納米粒子呈棒狀結構時比球狀或星狀具有更強的抗感染能力。

4 總結與展望

糖組學是繼基因組學、蛋白質組學后，生物化學領域的又一大科學研究前沿。由于糖鏈的結構與功能比核苷酸鏈和多肽鏈更加豐富和復雜，所以，糖組學的研究是一個非常龐大而又繁重的任務。致病菌-糖特異性識別是該龐大任務中很小但很重要的一個研究點，它可為致病菌的特異性分離、富集、檢測、鑒別、生物膜抑制以及抗生素替代藥物的篩選等提供新的解決方案。

本文總結了致病菌-糖特異性識別的機制機理及新型的研究方法和技術，重點歸納總結了近20年來相關的應用研究進展。致病菌之所以能夠粘附宿主細胞表面進而侵染細胞引起疾病，主要是因為其表面的凝集素與宿主細胞表面的聚糖發生多效價特異性識別。為了進一步闡明致病菌-糖特異性識別的機制，并將該類機制應用到細菌檢測以及相關疾病的治療中，強有力的研究方法和技術必不可少。本文重點介紹了既能用于機制研究、結合親和力計算，又能用于細菌檢測、藥物篩選的4種檢測技術，即熒光光譜、表面等離子體共振、電化學阻抗譜和石英晶體微天平。熒光技術在生物成像、標志物追蹤方面具有獨特優勢。其余3種技術均具有無需標記的優點，可以盡可能的避免外來物質的干擾，使檢測體系變得更加簡單且接近于生物體系本身。同時，這4種檢測技術都易于集成到微陣列芯片或微流控芯片平臺上，通過它們的結合，研究快速、靈敏、高通量、便攜化的檢測新方法將是目前乃至今后一段時間的研究熱點。

以糖作為致病菌檢測、鑒別的特異性識別受體，以糖類化合物或糖納米粒子作為抑制細菌感染和生物膜形成的替代藥物是基于致病菌-糖特異性識別機制研究的具體應用，但目前還停留在實驗研究階段，并未進行實際應用。主要面臨的挑戰有以糖作為識別受體具有交叉特異性，使得檢測特異性降低。再者，致病菌的同一條染色體所攜帶的基因會表達多種凝集素，當其所表達的凝集素不同時，糖類藥物抑制其感染的效果會變差。同時，單糖對致病菌凝集素的親和力很低，并不能有效抑制其感染，所以了解致病菌凝集素的表達規律，設計并合成結合親和力強、生物相容性好的糖化合物或糖微米/納米粒子是目前該領域研究的重點。

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Specific Recognition of Pathogenic Bacterium towards Glycan and Its Applications in Analytical Chemistry

CUI Fei-yun1,3,4,XU Yi1,2,3,4*,ZHAO Bin1,3,4,CHE Yu-lan1,3,4,LIU Lu-lu1,3,4

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Microsystem Research Center,School of Optoelectronic Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China; 2.Defense Key Disciplines Lab of Novel Micro-Nano Devices and System Technology,Chongqing University, Chongqing 400044,China;4.International R&D Center of Micro-Nano Systems and New Materials Technology,Chongqing University,Chongqing 400044,China)

Pathogen adhesion to host tissue is a prerequisite for a majority of infectious diseases.A common way for accomplishing adhesion is specific recognition of bacterium cellular lectins towards glycan on the surface of the host cells.Therefore,research on pathogenic bacteria-glycan interactions is beneficial to further understand the pathogenic mechanism of infectious diseases.Meanwhile,it could provide new strategies for specific detection on pathogenic bacteria and treatment of infectious diseases,and the mechanisms related with adhesion of pathogenic bacteria,carbohydrate-lectin interactions and multivalent interactions were summed up.The analysis technologies of pathogenic bacteria-glycan interactions were introduced,especially,the latest development and research of surface plasmon resonance,quartz crystal microbalances,fluorescence spectrum and electrochemical impedance spectroscopy were summarized.Special attention was paid to the combination of those detecting technologies and microfluidic chip platforms.In view of the serious problems of antibiotics resistance and poor specificity of pathogenic bacteria detection,the applications of bacterial isolation,enrichment,detection,identification,biofilm inhibition and the screening of antimicrobial agents were reviewed.Finally,the future development for basic research and application of pathogenic bacteria-glycan interactions were prospected.

carbohydrate-lectin interactions;multivalent interactions;bacterial adhesion;bacterial detection；review

2016-12-15；

2017-02-07

國家自然科學基金項目(21375156)；國家高技術研究發展計劃(863)項目(2015AA021104)；重慶市前沿研究重點項目(cstc2015jcyjBX0010)；重慶市科技惠民項目(cstc2015shmszx00014)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.021

O657.1;R379

A

1004-4957(2017)06-0817-12

*通訊作者：徐 溢，博士，教授，研究方向:微流控芯片生化分析，Tel:023-65111022，E-mail:xuyibbd@sina.com