食品中霉菌毒素樣品前處理及分析方法研究進展

譚 杰，杜苑琪，肖小華，李攻科

(中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275)

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食品中霉菌毒素樣品前處理及分析方法研究進展

譚 杰，杜苑琪，肖小華*，李攻科*

(中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275)

霉菌毒素廣泛存在于食物和動物飼料中，可經食物鏈傳遞危及動物與人體健康，帶來嚴重的食品安全問題。食品基體復雜，霉菌毒素結構多樣、含量極低，其分離分析需要高效的前處理技術及快速靈敏的分析方法。該文綜述了基于分子印跡聚合物、量子點材料、石墨烯類碳材料、生物材料等新型分離介質的固相(微)萃取、液相(微)萃取、免疫親和層析、磁分離等樣品前處理技術及液相色譜-質譜、免疫分析法、生物傳感器等分析方法在食品霉菌毒素分析中的應用，并展望了其發展趨勢。

食品；霉菌毒素；樣品前處理；分析方法；綜述

霉菌毒素是霉菌的次生代謝產物，不僅可使血管發生擴張、收縮或對中樞神經系統產生嚴重傷害，而且有些毒素(如黃曲霉毒素)還具有嚴重的致癌、致畸、致突變性[1]。霉菌毒素根據其繁殖環境可分為田間霉菌毒素和倉儲霉菌毒素，其中田間霉菌毒素是農作物在田間生長過程中受霉菌污染而分泌，主要包括萎蔫酸、煙曲霉毒素、念珠菌毒素、單端孢霉烯毒素、嘔吐毒素、蛇形菌素等；倉儲霉菌毒素是谷物在儲藏過程中受霉菌污染而產生，主要包括黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)、青霉菌毒素等。根據其化學結構不同，霉菌毒素可分為剛性共面苯環結構(如黃曲霉毒素)、部分共面結構(如玉米赤霉烯酮(也稱F-2毒素)和赫曲霉毒素(OTA))以及非共面倍半萜烯結構(如嘔吐毒素和T-2毒素)3大類，常見的毒素結構如圖1所示。

霉菌毒素廣泛存在于花生、蠶豆、豌豆、玉米、小麥等食物中，尤其是易被霉菌污染的谷物、堅果、果脯、咖啡、可可粉、香料、油籽、干豌豆、黃豆等。這些食物在生產、加工、運輸和儲藏過程中的任一環節均可能受到霉菌的污染，而霉菌毒素普遍耐高溫、化學性質極其穩定，因此常規的食物加工條件無法將它們破壞或除去[2]；食用含有這些霉菌毒素的食物可導致人體一系列疾病[3]，從而引發嚴重的食品安全事件。因此，對食品中霉菌毒素進行快速準確分析檢測具有重要意義。但是，這些毒素的化學結構差異大、含量跨度范圍廣且樣品基體復雜多變，其快速高效的樣品前處理方法和靈敏準確的分析方法研究成為近年來的熱點。目前，基于分子印跡聚合物(MIPs)、量子點材料(QDs)、石墨烯類碳材料、生物材料等新型分離介質的高效樣品前處理技術[4]如固相萃取(SPE)、QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)、液相微萃取、磁分離、免疫親和層析等，以及酶聯免疫吸附法(ELISA)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[5]和生物傳感器等高靈敏分析方法在霉菌毒素分析中的應用越來越多。本文綜述了近年來食品中霉菌毒素的樣品前處理技術和分析方法研究進展，并展望了其發展趨勢。

圖1 常見霉菌毒素的分子結構Fig.1 Molecular structures of typical mycotoxins

1 霉菌毒素樣品前處理方法研究進展

常用的霉菌毒素樣品前處理方法有固相萃取法、QuEChERS法、液相微萃取法、免疫親和層析法與磁分離技術等，表1總結了常用的霉菌毒素樣品前處理方法的適用范圍及優缺點。

表1 常用的霉菌毒素樣品前處理方法的適用范圍及優缺點

1.1 固相萃取法

固相萃取法(Solid-phase extraction，SPE)是目前食品中霉菌毒素分析的主要前處理方法。需要根據霉菌毒素的結構和性質選擇合適的吸附劑，傳統的吸附劑包括硅藻土、人造絲、藍棉、C18、聚合物吸附劑[14]等。近年來，一些新的分離介質如石墨烯類碳材料、分子印跡材料、金屬有機骨架(MOFs)材料等逐步得到應用。Wang等[15]比較了C18，PSA，HLB，MCX，Silica，NH26種不同吸附劑對鏈格孢毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、棒曲霉素和桔青素等8種霉菌毒素的吸附效果，發現MCX和NH2的吸附效果較好。

碳納米管、石墨烯等碳材料具有較大的比表面積和良好吸附性能，常用于SPE等前處理方法中。將多壁納米管涂覆到十八烷基硅膠修飾的磁性納米粒子上后[16]，這類磁性納米粒子對霉菌毒素具有很好的吸附效果，可用于玉米中痕量玉米赤霉烯酮(ZEN)及其次級代謝產物(包括β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮)的富集和凈化。將含羧基的氧化石墨烯與含氨基的二氧化硅微球偶聯制得的二氧化硅-氧化石墨烯復合材料作為固相萃取材料，利用氧化石墨烯的良好吸附能力，用于植物油中黃曲霉毒素 B1(AFB1)和B2(AFB2)的高效富集[17]，經HPLC分析后的檢出限分別為0.17，0.05 μg/L。

采用分子印跡材料作為吸附劑，可改善SPE的選擇性并提高分析方法的靈敏度[18-20]，其與固相萃取、固相微萃取等聯用技術可進一步解決樣品中的基質干擾問題。如以商品化的印跡萃取柱AFFINIMIP富集啤酒、紅酒、葡萄汁中赭曲霉毒素時[21]，單支萃取柱可循環使用10次以上。將OTA印跡材料通過大孔膜密封在微固相萃取柱中，富集后將萃取柱取出并超聲解吸[22]，結合HPLC方法可高靈敏地分析咖啡、葡萄汁和尿液中的赭曲霉毒素，其檢出限低至0.06 ng/g和0.02 ng/mL。Abou-Hany等[23]采用4種結構類似交鏈孢霉素的模板制備分子印跡聚合物微粒，實現了西紅柿等樣品中交鏈孢霉素的選擇性富集測定。由于霉曲毒素標準品量少價高，直接采用目標毒素作為模板分子的成本較高。因此，采用便宜易得、具有類似化學結構的化合物作為替代模板分子開展印跡聚合物研制受到了廣泛關注，如以2-萘甲酸作為桔霉素的替代模板、2,4-二羥基苯甲酸環十二酯作為ZEN的替代模板[24]；以吡啶甲酸為鐮孢菌酸的模板分子[25]；或以N-(4-氯-1-羥基-2-萘甲酰基氨基)-L-苯丙氨酸作為OTA的替代模板[26]等。此外，以摻雜 Al3+的硅溶膠為功能單體，赭曲霉毒素為模板分子時，Al3+的原子軌道與赭曲霉毒素的羥基產生強配位并取代硅烷水解后的羥基氫，從而提高分子印跡聚合物膜的穩定性和特異性識別能力[27]，這種配位印跡電化學傳感器對赭曲霉毒素有良好的選擇性和靈敏度。

SPE方法簡單、富集效率高且易于與液相色譜在線聯用，可減少樣品損耗并提高方法靈敏度[28-30]，Campone等[31]建立了牛奶和奶制品中AFM1的在線SPE-UPLC/MS分析方法。采用鹽析液液微萃取去除樣品中的蛋白質并萃取分析物后，將萃取液固相萃取富集、凈化并在線分析，整個在線分析時間不足20 min，方法的定量下限可低至0.5～0.6 ng/kg，低于歐盟限量標準25倍以上。

1.2 QuEChERS法

QuEChERS的原理與高效液相色譜(HPLC)和固相萃取(SPE)相似，利用吸附劑填料與基質中雜質相互作用而達到除雜凈化的目的。因其可分析對象的范圍廣、分析速度快、溶劑使用量少，近年來已逐漸成為霉菌毒素分析的常用前處理手段。Liu等[32]將芝麻醬樣品用乙腈水溶液提取、硫酸鎂和氯化鈉鹽析后，用正己烷和C18凈化，并結合UHPLC-MS/MS分析了黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等26種霉菌毒素，其檢出限低于歐盟允許的最大殘留量。采用QuEChERS/氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)測定爆米花中的多種毒素(嘔吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌酮-X、玉米赤霉烯酮)時[33]，其檢出限和定量下限分別小于65，196 μg/kg。此外，QuEChERS法也成功地用于葛根[34]、香菇[35]和雞蛋[36]等食品中數十種霉菌毒素的同時分離富集分析。

Frenich 等[37]采用 QuEChERS/UHPLC-MS/MS 法測定了蛋制品中的 10 種毒素(白僵菌素、環肽 A、環肽 A1、環肽 B1、桔霉素、AFB2、AFG1、AFB1、AFG2和 OTA),檢出限為 1.0～5.0 μg/kg。Zhou等[38]結合分散固相萃取法和QuEChERS法對樣品預處理后，用電噴霧串聯質譜儀在負離子MRM模式下進行測定，建立了面粉中10種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法。Sun等[39]將谷類樣品用0.1%甲酸乙腈溶液提取后，采用QuEChERS法凈化，建立了谷物中25種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法，檢出限為 0.03～15 μg/kg。QuEChERS法與LC-MS/MS進行聯用后，不僅可實現多種類別物質的分析，同時大大提高了分析通量，擴展了其應用范圍。Dzuman等[40]建立了389種多類別食品有機污染物(323種農藥殘留，55種霉菌毒素和11種吡咯烷類生物堿)的QuEChERS/HPLC-HRMS/MS分析方法，該方法在小麥、韭菜和茶葉中得到成功應用。

QuEChERS法作為一種廣譜性的殘留前處理技術，已被廣泛用于各類初級農產品、水產品、乳制品、深加工食品、生態環境和紡織品等基質中農藥、獸藥、毒素和其它污染物的分析。食品中霉菌毒素廣泛且種類繁多，QuEChERS在食品檢測領域中是較為常用的前處理方法，可對不同類別的物質進行同時分析檢測，節約了大量的溶劑和分析時間，Pizzutti等[41]采用QuEChERS法提取和凈化，建立了葡萄酒中36種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法。采用類似方法分析谷物中22種殺蟲劑和17種霉菌毒素時[42]，方法的檢出限可低至0.20～29.7 μg/kg。Romero-González等[43]分析了小麥、黃瓜和紅酒中約90種食品有機污染物(農藥、生物農藥和霉菌毒素)，霉菌毒素有黃曲霉毒素(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2)，赭曲霉毒素A，T2毒素，HT-2毒素，發現QuEChERS結合HPLC-MS可成功應用于實際樣品中目標物的測定。總體而言，QuEChERS法的應用對象不受限制，液態、固態和粘稠態等狀態的物質均能應用，通過與LC-MS分析方法相結合，可分析的對象多，分析速度快，準確度高，在食品領域中發揮著十分重要的作用。

1.3 液相微萃取

圖2 通過pH 值調節的分散液液微萃取的基本原理[46]Fig.2 Schematic illustration of pH-controlled dispersive liquid-liquid microextraction[46]

液相微萃取(Liquid-phase microextraction,LPME)法集萃取、濃縮于一體，因具有消耗溶劑少、富集效率高、操作簡單等優點而得到快速發展和應用。正庚醇、正辛醇、甲苯等中低極性溶劑是常用的萃取劑。如Rempelaki等[44]以甲苯為萃取劑，建立了啤酒中玉米赤霉烯酮的LPME-LC/MS分析方法，檢出限為0.44 μg/kg。分散液液微萃取(Dipersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是近年來一種新的液相微萃取形式，它通過微量注射器將萃取劑注入樣液中，在分散劑-水相內形成萃取劑微珠，擴展了萃取劑與水樣的接觸面積，從而可加快萃取平衡，提高萃取效率和富集倍數。采用氯仿和乙腈分別作為萃取劑和分散劑時，啤酒中玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)的富集因子為43.3，萃取液經HPLC分析后，其檢出限為0.12 pg/μL[45]。最近，Campone等[46]建立了一種基于pH值控制的DLLME方法，通過不同pH值下的2個連續DLLME過程來實現。谷物樣品先用甲醇萃取，萃取液中的疏水性雜質在pH 8.0的條件下用氯仿去除(一級DLLME)，然后將上清液調至pH 2.0，OTA用二溴乙烷濃縮(二級DLLME)，然后采用HPLC分析，OTA的檢出限和定量下限分別為0.019，0.062 μg/kg，其基本原理如圖2所示。該方法不僅可改善分散液液微萃取的選擇性，還可拓展其在可電離化合物分離富集中的應用。

離子液體是一種結構可調、化學物理性能獨特的新型綠色溶劑，Bozkurt等[47]以1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺離子液體為分散液富集玉米赤霉烯酮，建立了啤酒和谷物食品中玉米赤霉烯酮的DLLME/HPLC分析方法，檢出限為0.25 μg/L。而以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體為渦旋輔助分散液液微萃取的萃取劑時[48]，玉米類食品中玉米赤霉烯酮的HPLC方法檢出限為0.3 μg/kg，這些應用均表明離子液體在霉菌毒素分離富集中具有良好的應用潛力。

1.4 免疫親和層析

免疫親和層析(Immunoaffinity chromatography，IAC)是利用生物體內抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離，其選擇性好、富集效率高。目前，黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雜色曲霉素[49]等霉菌毒素的免疫親和柱均已商品化。Xie等[50]將活化的瓊脂糖珠與AFB1單克隆抗體蛋白偶聯制得AFB1免疫親和柱，建立了大豆、玉米、小麥等13種食品中AFB1的免疫親和柱/超高效液相色譜-串聯質譜法(IAC /UPLC-MS)分析方法，檢出限低至0.01～0.05 μg/kg。而將冰激凌樣品的磷酸鹽(PBS)提取液經免疫親和柱凈化后采用UPLC-MS/MS分析，AFM1的檢出限低至0.4～3.0 ng/kg[51]。為進一步將高效的IAC富集和快速的光分析法結合，Duan等[52]通過微乳化技術封裝CdSe/ZnS制備出量子點微珠，并將量子點置于免疫層析裝置中測定玉米赤霉烯酮(ZEN)，方法的檢出限為3.6 μg/kg，其交叉反應表明其他霉菌毒素對ZEN無干擾，可用于實際樣品中ZEN的快速篩查。

部分商品化的免疫親和柱也可用于多種霉菌毒素的同時富集，如蜂花粉中的黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)和赭曲霉毒素(OTA)[53]；豬肉、魚肉、豬肝等動物源食品中的6種黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1和AFM2)和6種玉米赤霉醇類真菌毒素[54]以及小麥、玉米及其制品中的黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)、赭曲霉毒素、伏馬菌素(B1,B2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、T-2以及HT-2等[55]。結合HPLC-MS/MS方法，毒素的檢出限一般可低至0.05 μg/kg數量級，遠低于歐盟的限量標準。為了進一步提高免疫親和柱的同時分析能力，研制新型多毒素免疫親和柱得到了較多關注。Zhang等[56]先制備AFs，OTA，ZEN和T-2毒素的單克隆抗體，將4種抗體與瓊脂糖-4B結合制備得到多抗體的免疫親和柱(mIAC)，結合HPLC-MS/MS分析了農產品中的7種霉菌毒素，方法的檢出限為0.04～0.4 μg/kg。Hu等[57]采用自制的多毒素免疫親和柱同時富集黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)，ZEN，OTA，雜色曲霉素和T-2毒素，使用HPLC方法分析的檢出限為0.006～0.12 ng/mL，該方法已成功用于80多種飼料中霉菌毒素的分析，具有快速、靈敏度高且耐用等優點，符合中國和歐盟國家的分析標準。

1.5 磁分離(Magnetic separation)

磁分離技術是將物質進行磁場處理的一種技術，材料與目標物在外加磁場的作用下發生相互作用而實現強化分離。Turan等[58]制備了分子印跡磁性微球，建立了葡萄汁中赭曲霉毒素的印跡微球萃取/紫外光譜分析方法。材料的飽和吸附量為34.5 mg/g，印跡因子為3.9，方法檢出限為0.374 μg/mL。Xu等[59]通過磁性靜電紡絲控制磁性，建立了一種黃曲霉毒素B1的高靈敏免標記電化學發光分析方法。它通過靜電紡絲良好的導電性能和生物相容性、較大的比表面積，以及可放大魯米諾電化學發光信號的特性，將黃曲霉毒素B1(AFB1)與特異性抗體相結合，經過電化學發光信號放大后,AFB1的檢出限為0.02 ng/mL。該方法已成功應用于實際樣品的檢測，且穩定性和重現性好。Taherimaslak等[60]以乙二醇雙巰基乙酸酯修飾的磁性Fe3O4納米微球富集AFM1，采用β-環糊精作為熒光增敏試劑，建立了牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的分析方法。高表面積和磁性特性使該方法比傳統的固相萃取法更快速，其富集因子更高(約57)，檢出限更低。Mashhadizadeh等[61]采用同樣的材料富集谷物中的赭曲霉毒素，建立了谷類食物中赭曲霉毒素的SPE/HPLC分析方法，該方法對大米、小麥和玉米樣品中赭曲霉毒素的檢出限分別為0.06，0.03，0.05 ng/mL。

另一方面，采用高分散磁性四氧化三鐵微球吸附抗體后，大大降低了ELISA方法中AFB1的檢出限[62]，可檢出實際樣品提取液中低至2 pg/mL的AFB1。Urusov等[63]通過磁性四氧化三鐵微球固定抗體后，大大減少了樣品基體的影響，加快了樣品處理速度并降低了ELISA方法的檢出限，提高了方法靈敏度。大麥和玉米萃取液中黃曲霉毒素B1的檢出限低至20 pg/mL，而總分析時間僅需20 min，大大優于常規的ELISA方法。經抗體修飾的磁珠可用作免疫磁珠探針，如Wang等[64]將黃曲霉毒素B1抗體用金納米粒子標識后，用黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物修飾磁珠并以其作為探針，將探針與金納米粒子標記的抗體相結合，磁分離后未結合的溶液則直接通過紫外光譜分析。該方法的檢出限為12 ng/L，赭曲霉毒素、T2毒素等不干擾黃曲霉毒素B1的檢測。霉菌毒素經免疫磁珠分離后，通過色譜等方法進行分析，可進一步提高分析方法的靈敏度和準確度。邢言言等[65]通過將N-羥基丁二酰亞胺偶聯磁珠與抗黃曲霉毒素抗體偶聯得到免疫磁珠，建立了陳皮中 4 種黃曲霉毒素的免疫磁珠分離/超高效液相色譜(UHPLC)分析方法，檢出限為0.013～0.038 μg/kg。

經抗體修飾的免疫磁珠可與IAC結合使用，用于霉菌毒素的快速檢測。黃艷梅等[66]以噴涂了檢測抗原黃曲霉毒素M1-BSA 和驢抗鼠二抗形成檢測線和質控線的硝酸纖維膜制備免疫層析試紙條，采用乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽-N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)法制備偶聯了AFM1單克隆抗體的免疫磁珠。將免疫磁珠與待檢樣本混合，經捕獲、磁分離后，濃縮重懸液直接采用免疫層析試紙條檢測，建立了集濃縮樣本與免疫層析于一體的AFM1快速檢測法。方法用于原料乳中AFM1的檢測，檢出限為0.1 μg/L，低于我國制定的AFM1限量標準(0.5 μg/L)，與其它真菌毒素和原料乳中常檢的違法添加物無交叉反應，分析結果與酶聯免疫吸附法(ELISA)結果吻合，有很好的應用前景。

1.6 超聲波輔助萃取法(UAE)

在食品等復雜樣品中痕量霉菌毒素的分離分析中，霉菌毒素的分離主要分為2個過程：毒素從樣品中轉移到萃取溶劑，以及毒素從溶劑中被分離富集。其中第一個過程相對較慢，決定了萃取速度；第二個過程相對較快，決定富集效率。近年來，采用熱、聲、電、磁、力及微波場等外場輔助萃取技術通過外場強化樣品處理過程中的傳熱和傳質過程，加快了樣品處理速度，提高了樣品處理效率。其中，UAE可通過超聲波的空化作用增加溶劑進入樣品的滲透性，加強其傳質過程，提高樣品中目標組分的萃取率，近年來在食品、環境、生物、醫藥等領域應用廣泛，在霉菌毒素的分離分析中應用越來越多。如采用UAE方法可增加谷物產品中赭曲霉毒素的提取效率[67]。在實際應用中，一般將UAE與其他富集方法(如分散固相萃取、分散液液微萃取、QuEChERS等方法)結合使用，在提高樣品處理速度的同時提高霉菌毒素的富集效果，結合高靈敏分析方法實現霉菌毒素的高效高靈敏分析。如采用超聲輔助-分散固相萃取結合HPLC分析奶粉中的AFM1[68]、超聲波輔助-分散液液微萃取/HPLC分析水果中OTA和橘霉素[69]、超聲波輔助-微QuEChERS萃取/UPLC分析谷類食物中的玉米赤霉烯酮(ZEN)[70]等，均能大幅減少溶劑消耗和樣品損失，并使霉菌毒素的檢出限低至μg/kg以下水平。Kong等[71]將肉豆蔻樣品用UAE萃取后，采用商品化的免疫親和柱凈化富集，用HPLC-光電衍生-FLD分析，建立了一種超聲輔助-固液萃取/免疫親和柱/柱后光電衍生-高效液相色譜法分析多種毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2，OTA)的方法，檢出限和定量下限分別為0.02～0.25 μg/kg和0.06～0.8 μg/kg，并成功用于13種市售肉豆蔻中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的高靈敏分析檢測。

2 霉菌毒素分析方法研究進展

霉菌毒素經過不同前處理方法處理后，一般采用液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、免疫分析法、熒光分析法等方法進行分析。以OTA分析為例，表2列出了不同樣品中OTA的分析方法及其結果對比情況。

表2 不同樣品中OTA的分析方法及其結果對比

從表2可以看出，霉菌毒素存在于各類食品中，QuEChERS法可對各類樣品進行前處理，能滿足高通量的分析需求，結合液相色譜質譜聯用技術甚至對不同類別的物質也能同時分析，是霉菌毒素分析的主要前處理方法；LC-MS/MS分析方法與前處理技術的聯用則能達到更高的靈敏度，同時液相色譜應用面廣，成為霉菌毒素分析的主要方法。

2.1 液相色譜及液相色譜-質譜聯用

高效液相色譜(HPLC)和液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)方法簡單、快速、靈敏和高通量，是目前霉菌毒素分析通行的標準方法。采用LC-MS分析飼料中多種霉菌毒素及其代謝物[72]，其檢出限為0.11～0.60 μg/L。結合SPE和QuEChERS等高效樣品前處理技術可進一步提高分析方法的靈敏度和準確度，如采用微固相萃取/液相色譜-串聯質譜(LC-MS)對飲料和罐裝咖啡等食物中的黃曲霉毒素進行分析[73]。在LC-MS中采用多反應監測模式下的正離子和負離子同時檢測，可實現數十種霉菌毒素的同時分析檢測。如Liu等[74]以ZEN作為內標物，建立了檳榔中11種霉菌毒素的UHPLC-ESI-MS/MS分析方法，定量下限低于50 μg/kg，檢出限為0.1～20 μg/kg。

2.2 氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)

由于霉菌毒素的揮發性較低、熱穩定性高，因此與HPLC-MS法相比，GC-MS法在霉菌毒素的實際檢測中存在一定的局限性，目前主要用于鐮刀霉菌毒素及棒曲霉素等的分析檢測。如Yelko等[75]建立了谷物中單端孢霉烯族毒素、棒曲霉素和ZEN毒素的QuEChERS/氣相色譜-質譜聯用分析方法，定量限低于10 μg/kg，相對標準偏差低于9%。Pereira等[76]采用類似方法同時檢測了嬰兒食品中12種棒曲霉素，方法的檢出限和定量下限分別為0.37～19.19 μg/kg和1.24～63.33 μg/kg，該方法已成功用于9種市售嬰兒食品中棒曲霉素的檢測。通過樣品衍生化方法可拓展GC-MS方法在霉菌毒素分析中的應用，如Qian等[77]將食用植物油中的玉米赤霉烯酮及其5種衍生物毒素用含0.1%三甲基氯硅烷的N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺硅烷衍生化后采用GC-MS分析，方法的定量下限為0.03～0.2 μg/kg，回收率為80.3%～96.5%，可滿足分析要求。

2.3 免疫分析法

免疫分析法也是食品中霉菌毒素較常使用的分析方法。其中，酶聯免疫吸附法(ELISA)因特異性強、靈敏度高、使用簡單而應用較多。目前，商品化的ELISA檢測試劑盒已推向市場，主要包括黃曲霉毒素、OTA、ZEN等。但ELISA一般只能檢測一種物質且受基體影響，易導致“假陽性”，常用于實際樣品中霉菌毒素的快速初篩。曹冬梅等[78]基于G8-AP建立了檢測AFB1的一步 ELISA 法，檢出限為2.6 ng/mL。王呂等[79]以驢抗鼠二抗包被微孔板，以捕獲方式包被抗OTA單克隆抗體，利用噬菌體隨機七肽庫篩選 OTA 模擬抗原表位，并以其替代檢測抗原，建立了基于噬菌體展示技術的酶聯免疫吸附分析檢測OTA的方法，OTA 的檢出限為0.03 ng/mL。以合成OTA-牛血清白蛋白偶聯物作為抗原免疫 Balb/c小鼠產生高親和性抗OTA單克隆抗體，建立了靈敏的間接競爭酶聯免疫吸附測定法，該方法對OTA的檢出限為1.4 μg/kg[80]。用黃綠青霉素-牛血清蛋白(CIT-BSA)免疫 Balb/c小鼠得到CIT單克隆抗體，建立了靈敏的CIT間接競爭酶聯免疫吸附測定方法[81]；采用類似方法可建立AFB1的間接競爭酶聯免疫分析方法[82]。此外，Li等[83]制備了一種高度特異性、高靈敏度的抗T-2毒素單克隆抗體，該抗體僅與T-2毒素結合，能排除大多數毒素的干擾(包括HT-2毒素)，其檢測結果與UHPLC-MS/MS方法吻合。

在多種霉菌毒素同時檢測方面，Du等[84]建立一種分析多類霉菌毒素的斑點酶聯免疫法(dot-ELISA)，該方法能對多類霉菌毒素進行半定量分析。Venkataramana等[85]制備了一種高度特異性的OTA單克隆抗體，并建立了一種夾心斑點ELISA(s-dot ELISA)法，該方法對OTA的檢出限為5.0 ng/mL。ELISA能與金、硅等納米粒子產生共振現象，形成電漿ELISA。與傳統的ELISA方法相比，將納米復合材料-SiO2@PAA @CAT@OTA1∶1作為競爭性抗原，可提高電漿ELISA 法的靈敏度[86]，該方法對OTA的檢出限為5 × 10-20g/mL，如圖3所示。

圖3 基于過氧化氫酶催化長大的金納米粒子的定量免疫測定法示意圖[86]Fig.3 Schematic diagram of the proposed quantitative immunoassay based on CAT-catalyzed growth of AuNPs [86]

膠體金免疫層析技術是在酶聯免疫吸附法(ELISA)、單克隆抗體技術、膠體金技術、乳膠凝集試驗、免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的一種快速、靈敏的免疫檢測方法[87]。鄭百芹等[88]采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑 40 nm 的膠體金溶液，然后利用膠體金標記抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)單克隆抗體制備膠體金免疫復合物，建立了DON的免疫膠體金快速檢測方法。該方法在15 min內即可完成檢測，特異性、穩定性、準確性均較好，有望成為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇樣本的快速篩選手段。Kolosova等[89]建立了同時快速檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮毒素的側流免疫膠體金方法。10 min內即可快速可視化定性，可用于食品中霉菌毒素的現場篩選。采用包裹AFB1抗體蛋白的金膠體作為識別探針，將植物油的油相與水混合，之后在免疫試條上對AFB1進行可視化檢測，其檢出限為1.5 mg/kg，分析時間僅需5 min，該方法可實際應用于家用植物油中AFB1毒素的檢測[90]。

2.4 生物傳感器

生物材料的進一步發展主要體現在生物傳感器[91]、膠體金、適配體芯片等技術的應用[92-93]。杜祎等[94]將AFs氧化酶固定化后與過氧化氫電極構成電流型酶電極，構建了用于測定AFB1的生物傳感器，并成功用于花生樣品的測定，其測定結果與薄層色譜法、ELISA法有較好的一致性。基于固定乙酰膽堿酯酶構建的電導型生物傳感器可用于不同霉菌毒素的分析測定[95]，但更適合AFB1或總毒素含量的測定。而基于巰基乙胺自組裝膜構建的電化學傳感器[96]對串珠鐮刀菌毒素的檢出限為8.3× 10-10mol/L，且其結果與HPLC無顯著性差異。此外，Kong等[97]以研制的多免疫層析(IAC)試紙條對20種霉菌毒素進行半定量和定量檢測，其半定量檢測結果只需20 min即可通過肉眼觀察到，可用于現場檢測和谷物樣品中霉菌毒素的快速篩選。Pacheco等[98]在玻碳電極上先后修飾多壁碳納米管和分子印跡涂層，構建了一種OTA的電化學傳感器，其對OTA的檢出限為1.7 μg/L，定量下限為5.7 μg/L，已成功用于啤酒和白酒等實際樣品中OTA的分析檢測。將羧酸化的多壁碳納米管沉積到ITO表面，然后修飾AFB1單克隆抗體用于構建電化學傳感器[99]，可高靈敏、選擇性地分析AFB1，其檢出限低至0.08 ng/mL。周琳婷等[100]依次電沉積氧化石墨烯、2,5-二(2-噻吩)-1-對苯甲酸吡咯和氯金酸于金電極表面，以EDC/NHS為活化劑，將AFB1抗體共價連接在導電高分子膜上，最后滴涂1,3-二丁基咪唑六氟磷酸鹽離子液體于該修飾電極表面，制得AFB1免疫傳感器，該傳感器對AFB1的檢出限為1.1× 10-15mol/L，可用于花生等樣品中痕量AFB1的測定。

石墨烯的比表面積大且富含π電子，具有良好的熱穩定性及化學穩定性[101]，已作為性能優良的吸附材料廣泛應用于樣品前處理研究[102]。石墨烯經過適當處理可得到表面有羧基、羥基等活性基團的氧化石墨烯，進一步修飾得到的功能化石墨烯可用于食品、藥物、環境污染物、生物分子中痕量分析物的分離富集[103-104]。當使用氧化石墨烯納米片作為赭曲霉毒素適體(OTA-apt)的電化學探針時[105]，由于OTA-apt通過π-π 共軛作用力與氧化石墨烯選擇性結合，使得該探針具有較高的選擇性和抗干擾性。結合石墨烯材料良好的吸附能力和免疫分析的高靈敏檢測，構建了霉菌毒素高靈敏免疫傳感器。如在導電高分子膜的內外分別引入導電性好和比表面積大的石墨烯和納米金，可提高修飾層的電子轉移速率，制得的免疫傳感器對AFB1的檢出限低至 1.1×10-15mol/L[100]。將氧化石墨烯還原并與聚吡咯和吡咯丙酸復合，通過石墨烯增強穩定性和導電性，以吡咯丙酸充當共價連接體，制成免疫傳感器[106]，該傳感器對AFB1也具有高度選擇性和高靈敏度。此外，將磁性的Fe3O4-氧化石墨烯復合物作為吸附材料，抗體標記的CdTe量子點作為探針檢測AFM1[107]，檢出限為0.3 pg/mL；與商品化的酶聯免疫吸附試劑盒方法相比，該方法具有更高的靈敏度，更快的分析速度。

采用一步電沉積法將金納米粒子和殼聚糖沉積到金基微電極上，并進一步固載AFB1抗體構建無標記免疫傳感器[108]，將其用于玉米中AFB1的分析檢測，檢出限為0.19 ng/mL。采用端粒酶和EXO Ⅲ兩級放大策略構建電化學適體傳感器[109]，其對AFB1的檢出限可低至0.6×10-16mol/L。

與抗體相比，適配體的特異性更強，對目標靶分子具有更強的親和力，而且它們可根據需要在體外大量快速地制備合成，因此被廣泛用于霉菌毒素等化學物質的分析檢測[110-111]。Guo等[112]采用單壁碳納米管作為熒光猝滅劑，構建了羧基熒光素(FAM)-適配體傳感器，與傳統的傳感器相比，該方法對OTA的檢出限為24.1 nmol/L。張勇等[113]開發了一種便攜式適配體生物傳感器，結合血糖儀用于嬰幼兒米粉和羊草中OTA的定量檢測，檢出限為 6.7×10-9mol/L，回收率為84%～122%。文獻[114]基于氧化石墨烯(GO)阻止核酸酶切割破壞適配體，并調節GO尺寸得到AFB1的不同線性響應范圍，從而構建了一種基于納米氧化石墨烯(GO)和適配體修飾的AFB1的熒光傳感器，其檢出限可低至0.35 ng/mL。Dai等[115]將OTA適配體結合的近紅外上轉換納米顆粒(apt-UCNPs)和寡核酸苷修飾的磁性納米粒子混合得到復合材料，構建近紅外適配體傳感器并用于啤酒樣品中OTA的檢測，其檢出限為0.005 ng/mL。

2.5 熒光分析法(XRF)

量子點是一種新型的半導體熒光探針，具有獨特的量子效應、高的量子產率和光化學穩定性，其激發光譜寬且連續分布，已被廣泛用于生命化學、環境分析等領域[116]。采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)將OTA與量子點偶聯制備的熒光探針[117]，可高靈敏、快速檢測玉米中 OTA ，其單個樣品檢測時間為10 min。通過水包油反相微乳化作用將CdSe/CdS/ZnS核殼型量子點包裹于二氧化硅納米粒子中，然后進行氨基、羧基和環氧基修飾并用聚乙二醇片段穩定后，可得到穩定的熒光標記探針，該熒光標記探針與抗體共軛結合后可對嘔吐毒素進行快速、高靈敏度的現場測定[118]。量子點熒光探針在黃曲霉毒素分析中得到較多應用，如Speranskaya等[119]將CuInS2/ZnS量子點封裝于聚乙二醇中得到水溶性量子點，然后與AFB1-蛋白衍生物結合作為熒光探針對AFB1進行熒光測定。與傳統的酶聯免疫吸附法相比，該方法具有更高的靈敏度。采用CdTe量子點與AFB1單克隆抗體結合形成共軛配合物建立直接競爭熒光免疫吸附法，檢出限低至0.016 ng/mL[120]。此外，基于量子點與AFB1的結合，設計了基于熒光共振能量轉移的熒光探針，其結果與商品化AFB1的酶聯免疫吸附測定結果無顯著性差異[121]。

圖4 基于LMOF-241材料分析黃曲霉毒素[123]Fig.4 Analysis of aflatoxin based on the LMOF-241 materials [123]

環糊精的“內疏水外親水”空腔結構使其能與許多有機物和無機離子相結合，它們與黃曲霉毒素結合產生不同的光學現象。將β-CD-Hg 作為熒光增強劑替代國標方法的傳統衍生試劑，建立了高靈敏、快速測定AFB1的熒光分析法[122]，檢出限為0.08 μg/L，結果與國標方法及速測方法均無顯著性差異。Hu等[123]設計合成的新型發光金屬有機骨架材料LMOF-241(圖4)可通過熒光猝滅法實現黃曲霉毒素和OTA的靈敏檢測。

2.6 其他分析方法

近年來，熒光免疫法、近紅外光譜法也在霉菌毒素檢測分析中得到應用。將異硫氰酸熒光素(FITC)標記 AFB1抗體制得 FITC-AFB1熒光標記抗體[124]，建立了AFB1的直接競爭熒光免疫分析方法并用于中藥材中 AFB1的快速檢測，回收率為 90.4% ～106.6%。Hernandez-Hierro等[125]采用近紅外光譜儀分析了霉菌毒素，AFB1，OTA和總黃曲霉毒素的最小二乘法相關系數和預測修正的標準差分別為0.955和0.2 μg/kg、0.853和2.3 μg/kg、0.938 和0.3 μg/kg。與色譜法相比，近紅外光譜法采用光纖探頭，成本更低、分析速度更快，且不需粉碎、浸提、層析等繁瑣的樣品前處理過程，建立的霉菌毒素檢測軟件與校正模型能夠快速準確檢測霉菌毒素的含量，從而為實際樣品的快速篩選提供了依據。Arduini等[126]研制了一種同時采用比色法檢測AFB1和采用熒光法檢測OTA的便攜式光纖檢測儀，AFB1和OTA的檢出限分別為10，0.1 μg/L，可用于食品等樣品中AFB1和OTA的現場快速篩查。

3 展 望

霉菌毒素因存在范圍廣，對家禽、哺乳動物和人類健康具有嚴重危害而受到了社會的廣泛關注，世界各國紛紛制定了食品、飼料中各類霉菌毒素嚴格的檢測和限量標準。雖然色譜-質譜聯用技術、各種免疫分析和生物傳感器方法快速靈敏，一些針對食品中黃曲霉毒素等快速檢測的儀器也紛紛問世。但是，受色譜法冗長的前處理過程、免疫分析法的低通量和“假陽性”等的限制，發展高選擇性、高效、高通量的前處理技術，新的高靈敏分析方法，以及簡捷靈敏的前處理-分析檢測聯用技術如樣品前處理-色譜/光譜聯用技術將具有廣泛的發展空間和應用潛力。

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Progress on Pretreatment and Analytical Methods for Mycotoxins in Food Samples

TAN Jie,DU Yuan-qi,XIAO Xiao-hua*,LI Gong-ke*

(School of Chemistry,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

Mycotoxins are widely present in food and animal feed.They are harmful to animal and human health through the food chain,and will reduce the nutritional value of feed and cause serious food safety problem.It is very necessary to develop efficient sample pretreatments and sensitive analytical methods for rapid analysis of these targets in complex matrix.In this paper,some pretreatment methods including solid-phase microextraction,liquid-phase microextraction,magnetic separation,immuno affinity chromatography etc. are introduced.Meanwhile,the applications and developments of analytical methods for mycotoxins,such as liquid chromatography-mass spectrometry,enzyme-linked immune-sorbent assay and biosensors etc.,are also reviewed.

food samples;mycotoxins;sample pretreatment;analytical method;review

2017-01-22；

2017-02-20

國家自然科學基金項目(21375155,21475153，21675179，21675178)；國家重大科學儀器設備開發專項(2011YQ0301240901)；廣東省自然科學基金(2015A030311020)；廣東省公益研究與能力建設專項(2015A030401036)；廣州市民生科技重大專項資助項目(201604020165)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.022

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)06-0829-12

*通訊作者：肖小華，博士，副教授，研究方向：色譜、食品分析，Tel：020-84111664，E-mail：xiaoxhua@mail.sysu.edu.cn 李攻科，博士，教授，研究方向：色譜與光譜分析、復雜體系分離分析， Tel：020-84110922，E-mail：cesgkl@mail.sysu.edu.cn