22q11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術研究

蔣華景+陳靜+林麗璇

[摘要]目的 探討熒光原位雜交技術（FISH）聯合超聲心動圖對診斷22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的臨床價值。方法 于2013年1月～2014年12月選擇62名具有高危妊娠指征的孕婦，應用FISH技術檢測22q 11.2微缺失，并以超聲心動圖明確診斷。結果FISH檢出5例22q 11.2微缺失，超聲心動圖檢查結果3例為法洛四聯癥，2例為室間隔缺損。57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查結果三尖瓣輕度反流2例、肺動脈狹窄2例、動脈導管未閉1例。22q 11.2微缺失組與無微缺失組胎兒超聲心動圖表現異常率分別為100.00%和8.77%，差異有統計學意義（χ2=28.28，P<0.01）。結論FISH技術檢測胎兒22q 11.2微缺失，并配合超聲心動圖對心臟畸形進行明確檢查，臨床應用價值較高，值得推廣應用。

[關鍵詞]熒光原位雜交技術；超聲心動圖；22q 11.2微缺失；先天性心臟病

[中圖分類號] 714.43+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）05（c）-0062-04

[Abstract]Objective To discuss the clinical value of fluorescence in situ hybridization （FISH） combined with ultrasonic cardiogram on 22q 11.2 microdeletion accompanied with congenital heart disease （CHD）.Methods A total of 62 high risk pregnant women from January 2013 to December 2014 were chosen.The FISH technique was applied to detect 22q 11.2 microdeletion，and ultrasonic cardiogram was used to diagnose clearly.Results Five fetuses with 22q 11.2 microdeletion were detected，from whom 3 fetuses were diagnosed as tetralogy of Fallot，and 2 fetuses were diagnosed as ventricular septal defect.The ultrasonic cardiogram showed that 2 fetuses with tricuspid regurgitation slightly，2 fetuses with pulmonary stenosis and 1 fetus with patent ductus arteriosus were detected in 57 fetuses without 22q 11.2 microdeletion.Abnormality rate in group with 22q 11.2 microdeletion and group without 22q 11.2 microdeletion was 100.00% and 8.77% respectively，and difference was statistically significant （χ2=28.28，P<0.01）.Conclusion Detecting 22q 11.2 microdeletion with FISH technique and diagnosing clearly CHD with ultrasonic cardiogram has high clinical application value and it is worthy of clinical promotion and application.

[Key words]Fluorescence in situ hybridization；Ultrasonic cardiogram；22q 11.2 microdeletion；Congenital heart disease

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是臨床常見的胎兒先天性畸形，發病率為活產嬰兒的3‰～8‰[1]，也是目前嬰幼兒死亡的主要病因之一。CHD的發病受遺傳和環境等多種因素影響，目前研究表明，染色體22q 11.2微缺失與CHD關系密切，22q 11.2微缺失可以引發心臟缺陷，同時伴有唇裂/腭裂、胸腺發育不良、面容異常等先天畸形，因此被稱為22q 11.2微缺失綜合征。22q 11.2微缺失綜合征作為人類最常見的染色體缺失綜合征之一，發病率為1/4 000～1/6 000[2]，且75%～80%的22q 11.2微缺失微缺失病例可合并各種類型的CHD[3-5]。本研究采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術，對臨床疑似妊娠22q 11.2微缺失綜合征胎兒的高危孕婦進行產前檢測22q 11.2基因微缺失，并以彩色超聲心動圖明確診斷，旨在對胎兒進行早期干預，并提高22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2013年1月～2014年12月在本院產前檢查并檢測22q 11.2微缺失的高危孕婦62例，孕婦年齡28～43歲，平均（36.35±4.62）歲，胎齡13～33周，平均（23.64±4.28）周。根據妊娠周數，11～14周行絨毛穿刺3例，17～24周行羊膜腔穿刺23例，>24周行臍帶血穿刺36例。62名孕婦以往均引產或分娩過CHD或唇腭裂等面部畸形胎兒。所有研究對象均簽署知情同意書，研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

FISH診斷試劑盒（購自北京金菩嘉醫療科技有限公司），膠原酶B、RNase A酶、胃蛋白酶（均購自美國Sigma公司）。國產長風恒溫水浴箱、奧林巴斯BX51型熒光顯微鏡。

1.3 FISH檢測

根據孕齡取羊水10 ml、臍血2 ml或絨毛3～4枝，采用FISH診斷試劑盒，對標本22號染色體TUPLE1基因的微缺失進行檢測。GLP TUPLE1/GLP ARSA為待檢測的基因，TUPLE1：22q 11和ARSA：22q 13為探針的位點，其熒光信號分別為桔紅色和綠色，彼此互為內對照探針。嚴格按試劑盒說明進行操作，分別進行滴片、干燥、變性、雜交、后洗、染色和鏡檢等操作。如果TUPLEl探針與22q 11.21成功雜交，顯示桔紅色的熒光信號（四甲基羅丹明）；如果ARSA基因探針與22q 13.31成功雜交，則出現綠色的熒光信號（細胞綠）。TUPLE1和ARSA基因互為內對照。在奧林巴斯BX51型熒光顯微鏡下對雜交信號進行觀察，使用FISH VIDEOTEST 2.0軟件分析。FISH信號的評價規則：有效標本為細胞膜完整且細胞雜交率80%，對每份樣本隨機分析100個處于分裂中期狀態的細胞，22號染色體在細胞內呈綠色熒光，如果22q 11無缺失，22號染色體上應該還可顯示2個桔紅色熒光信號；如果只有1個桔紅色熒光信號，提示22q 11.2存在微缺失。若熒光信號正常的細胞≥90%，則胎兒染色體可診斷正常；若熒光信號異常的分裂狀態細胞>60%，FISH檢查結果陽性，提示胎兒存在22q 11.2微缺失。

1.4超聲心動圖檢查

參照“ISUOG 胎兒心臟篩查指南”[6]，超聲診斷儀為GE E8型。確認胎兒心臟方位后，在胎兒腹部橫切面，依據下腔靜脈、胃、腹主動脈等結構對心臟位置是否正常進行判斷；然后用超聲心動圖對胎兒三血管氣管的橫截面、三血管的橫截面、左右室流出道的橫截面及四腔心橫截面篩查胎兒CHD。

1.5統計學方法

數據采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，并采用配對McNemar檢驗比較兩種診斷方法的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 FISH 法檢測22q 11.2微缺失結果

62例高危孕婦中，共57例FISH檢測結果為>90%的細胞內有2個綠色熒光、2個桔紅色熒光信號，提示22q 11.2無微缺失。5例有60%以上細胞出現了2個綠色熒光、1個桔紅色熒光信號，提示存在22q 11.2微缺失。

2.2 超聲心動圖結果

5例22q 11.2微缺失胎兒超聲心動圖檢查結果3例為法洛四聯癥（圖1），2例為室間隔缺損。而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查結果三尖瓣輕度反流2例、肺動脈狹窄2例、動脈導管未閉1例，22q 11.2微缺失胎兒超聲心動圖表現為100.00%異常，而無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖表現異常率為8.77%，兩組差異有統計學意義（χ2=28.28，P<0.01）（表1）。FISH和超聲心動圖診斷結果的配對χ2檢驗顯示2種方法對胎兒心臟異常診斷的差異無統計學意義（χ2=5.00，P=0.06）（表2）。在FISH檢測結果和超聲心動圖結果出來后，對于確診為法洛四聯癥的3例胎兒，在孕婦及其家屬同意的情況下行引產手術，其他胎兒在征得孕婦及其家屬的同意下均活產，隨訪結局情況見表3。

3討論

CHD的發病率近年來呈增高趨勢，但其發病機制目前仍未完全明了。大部分觀點認為CHD是受遺傳和環境影響的多基因遺傳病，其中染色體畸變是出現CHD的主要病因，胎兒發育過程中極輕微的染色體畸變也能使附近的基因出現異常，并使心臟以及心外器官的發育受到影響，從而出現CHD和心畸形。而22q11.2微缺失綜合征是目前少數得到確認的致CHD的染色體畸變之一。Hartman等[7]的研究顯示CHD患兒中22q 11.2微缺失的發生率為12.2%。22q 11.2微缺失主要為染色體減數分裂之后重組時發生的異常與不對稱導致，微缺失大小為1.5～3 Mb，缺失區域處于D22S306/308與D22S427/1638間。活產兒中22q 11.2的發生率約為1/4 000[8]。22q 11.2微缺失綜合征已經被確認為除外唐氏綜合征的導致CHD的最為多見的遺傳因素。22q 11.2微缺失綜合征患者臨床表現為CHD、唇腭裂、面部畸形、免疫缺陷等，而CHD中發生率較高的主要為法洛四聯征、主動脈弓離斷、室間隔缺損、共同動脈干等，患兒的生長發育、學習認知能力都會出現異常或遲緩[9-11]，對其預后和生活質量帶來嚴重的不利影響。

研究顯示22q 11.2微缺失綜合征的主要致病基因為TUPLE1基因，它的畸變或缺失是引起CHD的主要原因之一[12]。FISH技術通過特異性探針與細胞雜交對TUPLE1基因進行檢測，能對胎兒是否發生22q 11.2 微缺失進行準確的診斷。FISH檢測不需要細胞培養，能適用于細胞周期的各個時期，具有標本采集后可立即檢測的優點，能在染色體原位顯色，定位精準直觀，結果判斷時只需對細胞進行計數、辨認是否有雜交信號，具有高度的靈敏性和特異度，成為臨床染色體微缺失檢測的金標準之一[13]。

染色體異常與胎兒的發育畸形，特別是CHD的發生密切相關。心臟超聲檢查能夠清晰直觀地顯示胎兒心臟圖像，通過將胎兒心臟的掃查切面從四腔心切面擴展到更多的標準切面，使心臟畸形的檢出率大為提高，因此超聲心動圖是診斷胎兒CHD的可靠方法[14-15]。染色體畸變常伴基因異常或缺失，因此，心臟畸形或心外畸形較為多發。研究顯示CHD胎兒的染色體異常發生率為25%～30%，而當合并有心外畸形時染色體異常發生率可高達40%[16]。通過產前的FISH檢查對胎兒進行22q 11.2微缺失的檢測，并結合心臟超聲影像學檢查，對提高CHD的產前診斷有顯著的臨床意義。本研究對62例高危孕婦進行FISH檢測，檢出5例22q 11.2微缺失，22q 11.2微缺失胎兒的超聲心動圖均顯示有心臟畸形，其中法洛四聯癥3例，室間隔缺損2例；而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查心臟畸形率為8.77%，兩組差異有統計學意義，說明22q 11.2微缺失與胎兒CHD的發生有較大的相關性，與閆亞妮等[17]的研究相似，同時也提示CHD是環境因素與多基因遺傳共同影響的結果，CHD的病因還需更深入的研究。應用FISH技術檢測22q 11.2微缺失，所需樣本量少、且操作簡便，具有靈敏度高、特異性強的特點。隨著標記技術和探針制備的發展，FISH技術對臨床胎兒CHD檢測的應用價值將進一步得到體現[16]。

本研究顯示，對高危孕婦進行FISH檢測以篩查22q 11.2微缺失，并結合超聲心動圖檢查以明確診斷，以減少和避免22q 11.2微缺失綜合征的患兒出生，降低圍生兒病死率，提升人口素質，值得臨床進一步推廣應用。

[參考文獻]

[1]肖蕾，王玲.產前超聲診斷胎兒先天性心臟病的研究進展[J].安徽醫藥，2013，17（8）：1416-1417.

[2]Zhang Y，Zhi Z，Jiang T，et al.Spherical mesoporous silica nanoparticlesfor loading and release of the poorly water-solubledrug telmisartan[J].J Control Release，2010，145（3）：257-263.

[3]Zhao P，Jiang H，Jiang T，et al.Inclusion of celecoxib into fibrousorderedmesoporous carbon for enhanced oral bioavailabilityand reduced gastric irritancy[J].Eur J Pharm Sci，2012， 45（5）：639-647.

[4]龔啟華，楊一峰，趙天力，等.22q11.2微缺失在貴州少數民族先天性心臟病患者中的研究[J].貴州醫藥，2016，40（4）：351-353.

[5]Bretelle F，Beyer L，Pellissier MC，et al.Prenatal and post-natal diagnosis of 22q11.2 deletion syndrome[J].Eur J Med Genet，2010，53（6）：367-370.

[6]Carvalho JS，Allan LD，Chaoui R，et al.ISUOG practice guidelines（updated）：sonographic screening examination of the fetal heart[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2013，41（3）：348-359.

[7]Hartman RJ，Rasmussen SA，Botto LD，et al.The contribution of chromosomal abnormalities to congenital heart defects：a population-based study[J].Pediatr Cardiol，2011，32（8）：1147-1157.

[8]李勝利.胎兒先天性心臟病的篩查和診斷[J].中國實用婦科與產科雜志，2010，26（12）：920-922.

[9]黃漢欽，冷永群，趙良橋，等.先天性心臟病患者開胸術后心電圖分析[J].實用心電學雜志，2015，24（5）：341-342，368.

[10]余秀明，呂航，劉鳴，等.法洛四聯癥術后心電變化一例[J].實用心電學雜志，2017，26（1）：68-71.

[11]張偉強，劉樹均，羅宇萍，等.先心封堵術后并發三支阻滯心電圖演變一例[J].實用心電學雜志，2017，26（2）：144-145，147.

[12]孫曉燕，王云英，甕占平，等.TUPLE1 基因缺失在先天性心臟病發病機制中作用的研究[J].中國優生與遺傳雜志，2013，21（2）：11-13.

[13]Tomita-Mitchell A，Mahnke DK，Larson JM，et al.Multiplexed quantitative real-time PCR to detect 22q11.2 deletion in patients with congenital heart disease[J].Physiol Genomics，2010，42A（1）：52-60.

[14]Fadda GM，Capobianco G，Balala A， et al.Routine second trimester ultrasound screening for prenatal detection of fetal malformations in Sassari university hospital，Italy：23 years of experience in 42，256 pregnancies[J].Eur J Obstet Gynecol ReprodBiol，2009，144（2）：110-114.

[15]趙婧，黃湘，李紅艷，等.熒光原位雜交技術在先天性心臟病產前診斷中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2015，12（23）：3512-3514.

[16]Locatelli A，Mariani S，Ciriello E，et al.Role of FISH on unculturedamniocytes for the diagnosis of aneuploidies in the presence of fetalanomalies[J].Fetal Diagn Ther，2005， 20（1）：1-4.

[17]閆亞妮，吳青青，姚苓，等.胎兒先天性心臟病與染色體及22q11微缺失異常的臨床研究[J].西安交通大學學報（醫學版），2014，35（2）：249-253.

（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：許俊琴）