HPLC測定芍藥甘草湯中甘草酸銨的含量

李墨+趙輝

[摘要]目的 建立芍藥甘草湯中甘草酸銨的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法，Phenomenex ODS柱（5 μm，250.0 mm×4.6 mm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸溶液，時間梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；檢測波長為237 nm；柱溫為30℃。結果 甘草酸銨進樣量在6.992～174.800 μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.9991），平均回收率為98.62%（n=6），RSD為0.28 %。結論 本方法操作簡便，結果準確、可靠，可用于芍藥甘草湯的質量控制。

[關鍵詞]芍藥甘草湯；甘草酸銨；高效液相色譜；質量控制

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）05（c）-0101-03

[Abstrac]Objective To establish an HPLC method for the content determination of ammonium glycyrrhetate in Shaoyao Gancao Decoction.Methods HPLC was performed on the Phenomenex ODS （250.0 mm×4.6 mm，5 μm）with acetonitrile-0.05% phosphoric acid with a gradient elution program as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min，237 nm as the detection wavelength，the temperature of column was at 30℃.Results The linear range of ammonium glycyrrhetate was 6.992-174.800 μg （r=0.9998） and the average recovery rate was 98.62% （n=6） with RSD 0.28%.Conclusion The results showed that this method was simple，accurate，reliable，and could be used for quality control of Shaoyao Gancao Decoction.

[Key words]Shaoyao Gancao Decoction；Ammonium glycyrrhetate；High performance liquid chromatography；Quality control

中藥方劑芍藥甘草湯出自東漢醫圣張仲景的《傷寒論·辨太陽病脈證并治上》，該處方由芍藥、炙甘草兩味中藥材組成，主治陰液虧虛、肝失疏泄，脾失健運，實驗顯示其具有抗炎、鎮靜、鎮痛等藥理作用，在臨床上被廣泛應用于消化、神經、呼吸系統還有婦科類病癥的預防與治療[1-6]。現代藥理實驗顯示，芍藥甘草湯主要有松弛骨骼肌、解痙鎮痛、抗潰瘍等作用，因此臨床使用非常廣泛[7-11]。兩味中藥在藥效方面有協同作用，甘草酸銨是方劑芍藥甘草湯中解痙鎮痛的主要藥效物質基礎[12-17]，經甘草配伍使用后療效生增強，體現了配伍“七情”中的相使。本研究采用高效液相色譜法測定對芍藥甘草湯中有效成分甘草酸銨進行含量測定，該方法可靠、簡單、靈敏，可用于芍藥甘草湯的質量控制和標準研究。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元梯度泵）；Bandelin Sonorex RK 1208BH超聲波清洗器；Memmert 8孔電熱水浴鍋；METTLER Toledo AB265-S電子天平（瑞士）。

1.2試劑與藥品

甘草酸銨（批號：110731-201116，購于中國食品藥品檢定研究院）。液相用甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，液相用水為Millipore超純水，其余試劑均為分析純。白芍、炙甘草均購于沈陽東北大藥房，經沈陽市紅十字會醫院藥劑科副主任藥師趙輝鑒定為真品，分別為毛茛科芍藥屬植物白芍（Paeonia lactiflora Pall.）、豆科甘草屬植物炙甘草（Radix Glycyrrhizae Preparata）。

2方法與結果

2.1芍藥甘草湯的制備

按芍藥甘草湯方劑構成取芍藥，甘草（炙）各10 g合并，每次加水8倍量、8倍量和6倍量煎煮3次，第1次的煎煮時間為1 h，后兩次的煎煮時間為1.2 h，合并煎液并過濾，減壓濃縮致干備用。

2.2色譜條件

Phenomenex ODS柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫見表1；檢測波長：237 nm。理論板數按甘草酸銨峰計算應≥5000。

2.3對照品溶液的制備

甘草酸銨對照品適量，精密稱定1.748 mg，精密加入10 ml 70%乙醇溶液，制成每1 ml含甘草酸銨174.8 μg的儲備液。

2.4供試品溶液的制備

取芍藥甘草湯提取物1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。對照品及樣品色譜圖見圖1、圖2。

2.5方法學考察

2.5.1方法專屬性 按選取的色譜條件，供試品溶液中的雜質對甘草酸銨的測定無干擾。

2.5.2線性關系 精密吸取對照品溶液10 μl進樣，以甘草酸銨的峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X）為橫坐標，采用多元回歸運算，得甘草酸銨的回歸方程分別為Y=2149X+1.725（r=0.9991）。結果顯示，甘草酸銨在6.992～174.8 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.5.3精密度試驗 取供試品溶液6份，按照選取的色譜條件測定，進樣10 μl，考察日內及日間精密度。結果顯示，甘草酸銨日內精密度（n=6）為0.96%；日間精密度（n=6）為1.24%。

2.5.4回收率試驗 稱取已知含量的芍藥甘草湯，精密加入一定量的甘草酸銨對照品，按供試品溶液的制備操作，制備中、低、高3種濃度（甘草酸銨）的樣品，每次平行操作（n=6），進樣10 μl，分別記錄其峰面積并代入標準曲線，計算出三種濃度對照品的質量濃度，以測定量與加入量的比值計算方法回收率及高、中、低3種濃度的回收率與RSD，結果見表2。

2.5.5樣品穩定性試驗 精密吸取供試品溶液，按選取的色譜條件測定，分別在0、1、2、4、8、12 h進樣10 μl，記錄峰面積，甘草酸銨RSD分別為0.56%、1.02%、1.16 %、1.08%、1.20%、1.15%，結果顯示，芍藥甘草湯樣品溶液在12 h內穩定。

2.6芍藥甘草湯提取物含量測定

按芍藥甘草湯提取物的制備方法制備3批芍藥甘草湯提取物，按本實驗所選取的色譜條件對3批芍藥甘草湯提取物進行測定，結果顯示，甘草酸銨含量為（141.60±3.511）μg/ml，RSD為2.45%。

3討論

本研究中，預試驗比較了乙腈-冰乙酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液的梯度洗脫系統，結果顯示乙腈-0.05%磷酸水溶液洗脫系統中出現的色譜峰較多且分離效果較好，能夠滿足液相圖譜對色譜峰的要求。采用DAD檢測器在210～400 nm范圍內波長采集光譜圖，在237 nm處有最大吸收，確定為最終檢測波長。流動相曾采用30%乙腈作溶劑，比較振搖與超聲預處理等試驗，對最后測定值影響比較小。本方法非常簡便，測定結果準確可靠，可用于芍藥甘草湯的質量控制。

芍藥甘草湯是出自《傷寒論》的經典名方，由芍藥、甘草2味中藥組成，其中芍藥酸寒、養血斂陰，甘草甘溫、健脾益氣。目前對芍藥甘草湯物質基礎的研究主要集中在對白芍、甘草的化學成分的孤立分析，并未對各化學成分之間的相互制約、相互協同作用作出整體評價，認為中藥及其復方的臨床療效就是各化學成分的作用的簡單加和，并以此來解釋芍藥甘草湯的臨床療效，這有悖于中醫藥整體觀理論，因此，隨著中藥研究的不斷深入以及中藥藥效組分理論的不斷發展，對芍藥甘草湯的藥效物質基礎研究也將更加明確，這對傳承中藥文化有積極意義。

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（收稿日期：2017-03-05 本文編輯：祁海文）