神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏中士的寧的控制方法及標(biāo)準(zhǔn)研究

甘曙光+胡吉迪+曹越

[摘要]目的 建立神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏中士的寧的含量測(cè)定方法，并制定其限量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用C18色譜柱，流動(dòng)相為A相（乙腈）∶B相（0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L KH2PO4等量混合溶液，用10% H3PO4調(diào)節(jié)pH值到2.8）=21∶79，流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果 線性范圍為54.048～2026.8 ng，r=0.9996，本方法的重復(fù)性和精密度良好（RSD<2.0%），其限量擬定為每100平方厘米含馬錢子以士的寧（C21H22N2O2）計(jì)為0.20～1.00 mg。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏中士的寧的含量測(cè)定，其限量客觀合理，保證了用藥的安全有效。

[關(guān)鍵詞]神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏；士的寧；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a content determination method of Strychnine in Shengnong Zhengtong Paste，and to set its limited quantity standard.Methods C18 chromatographic column was used， and the mobile phase was phase A （acetonitrile）∶phase B （0.01 mol/L heptane sodium sulfonate and 0.02 mol/L KH2PO4 of equal mixing solution，with 10% H3PO4 to adjust pH value to 2.8） =21∶79.The flow rate was 1.0 ml/min，the column temperature was 30 ℃，and the detection wavelength was 260 nm.Results The linear range was 54.048-2026.8 ng，r=0.9996，and the reproducibility and precision of this method was good （RSD<2.0%）.The limited quantity scheduled having maqianzi of 0.20-1.00 mg every 100 square centimeters calculating with Strychnine （C21H22N2O2）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the determination of Strychnine in Shengnong Zhengtong Paste.Its limited quantity is objective and rational to ensure the safety of drug use.

[Key words]Shengnong Zhengtong Paste；Strychnine；High performance liquid chromatography；Content determination

神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏的主要成分有三七、土鱉蟲，這些具有活血化瘀，通經(jīng)絡(luò)之功效，乳香、川芎、紅花、當(dāng)歸等成分對(duì)主藥的功效起到加強(qiáng)作用；防風(fēng)、馬錢子、白芷具有祛風(fēng)散寒的作用，冰片可以消腫止痛[1-2]。該產(chǎn)品能活性散瘀、消腫止痛[3-6]。馬錢子為馬錢科植物馬錢（Strychnos nux-vomica L.）的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫的功效。用于風(fēng)濕頑痹，麻木癱瘓，跌撲損傷，癰疽腫痛，小兒麻痹后遺癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛的治療[7-8]。但其性味苦，有大毒[1]，須對(duì)其用量進(jìn)行控制。馬錢子主要成分為士的寧[9-12]，本文參考《中國(guó)藥典》2010年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，以士的寧作為指標(biāo)，建立檢測(cè)方法，進(jìn)行了可行性研究，根據(jù)結(jié)果建立士的寧的檢測(cè)方法，通過(guò)樣品與參照藥對(duì)比研究，制定了控制范圍，并進(jìn)一步有效控制馬錢子的用量，保證用藥安全有效。

1 儀器與試藥

安捷倫HP1100高效液相色譜儀；島津SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀；WelchromTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ2200超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；士的寧（中檢所提供，含量測(cè)定級(jí)，批號(hào)：110705-200306）；神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏樣品（黃石燕舞藥業(yè)有限公司，規(guī)格為：9.5 cm×11.6 cm，20091101、20091102、20091103）；神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏參照藥（廣東湛江吉民藥業(yè)，規(guī)格：9.5 cm×11.6 cm，20081001、20081002）；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏樣品1片，除去蓋襯，對(duì)折，剪碎，置于錐形瓶中，加入二氯甲烷50 ml，加入濃氨試液1 ml，超聲提取30 min（100 W，50 kHz），冷卻至室溫，傾出二氯甲烷液，用適量二氯甲烷洗滌錐形瓶。合并二氯甲烷液，用稀硫酸溶液萃取3次（60、60、50 ml），合并硫酸液，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH至9～10，用二氯甲烷提取3次（60、60、50 ml），合并，回收二氯甲烷至干，殘?jiān)蛹状紡?fù)溶，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，混勻，過(guò)濾，即得。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備

取士的寧對(duì)照品適量，精密稱定，制成每毫升含40 μg/ml的甲醇溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取陰性對(duì)照樣品（無(wú)馬錢子），照2.1制備，即得。

2.2 色譜條件的建立

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取士的寧對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描（λ：190～800 nm），結(jié)果在255 nm附近有最大吸收，參照《中國(guó)藥典》2010年版一部，確定波長(zhǎng)為260 nm。

2.2.2流動(dòng)相的選擇

參照《中國(guó)藥典》2010年版一部及文獻(xiàn)，流動(dòng)相為A相（乙腈）∶B相（0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L KH2PO4等量混合溶液，用10%H3PO4調(diào)節(jié)pH值到2.8）=21∶79，結(jié)果顯示主成分峰與其他峰能完全分離，保留時(shí)間恰當(dāng)。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取2.1.1供試品溶液、2.1.2對(duì)照品溶液、2.1.3項(xiàng)陰性對(duì)照溶液，各進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果表明士的寧的保留時(shí)間為17.8 min左右，保留時(shí)間適中，即可以有效分離主成分，又能兼顧工作效率。陰性樣品（缺馬錢子）在此位置沒有色譜峰，樣品中雜質(zhì)與主成分峰分離良好。同時(shí)用DAD檢測(cè)器分別對(duì)樣品和對(duì)照品中的主成分峰進(jìn)行峰純度檢查，峰純度的match值為999.81，表明峰純度很好，即色譜峰中只含有1種組分（圖1～5）。

2.3.2 線性關(guān)系考察

配制濃度為5.4048、10.87、21.6192、48.6432、90.08、135.12、202.68 μg/ml的士的寧對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μl，以峰面積A對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，士的寧的進(jìn)樣量在54.048～2026.8 ng范圍內(nèi)時(shí)，Y=2.0156X+29.032（Y=峰面積，X=進(jìn)樣量，r=0.9996），該項(xiàng)結(jié)果表明，采用該色譜條件，檢測(cè)的靈敏度較高，線性范圍較寬，且線性關(guān)系良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏樣品6份，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定含量=0.51±0.00（n=6），RSD為0.16%。結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加樣回收的方法進(jìn)行考查，取已知含量的樣品（含量0.51mg/片）6份，分別加入濃度為198.66 μg/ml士的寧對(duì)照品溶液2 ml，按照上述方法檢測(cè)，根據(jù)加入的量和測(cè)得的量計(jì)算回收率，平均回收率為98.5%，RSD為0.4%。結(jié)果表明，本法回收率良好，專確度較高。

2.3.5 耐用性試驗(yàn)

2.3.5.1色譜柱的影響 考察了2種商品規(guī)格的色譜柱，取同一供試品溶液及對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)。含量測(cè)定結(jié)果一致（表1），2種商品規(guī)格的色譜柱均能達(dá)到較好的分離度。

2.3.5.2儀器的影響 選用2種不同的高效液相色譜儀，取同一供試品溶液及對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)。含量測(cè)定結(jié)果一致（表2），采用2種不同的儀器均能達(dá)到較好的分離度。

2.3.5.3樣品溶液的穩(wěn)定性考察 取神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏樣品，按照上述方法操作，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積=984.76±0.39（n=6），RSD為0.04%，結(jié)果表明，供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定，能夠滿足樣品檢測(cè)的需要。

該項(xiàng)結(jié)果顯示，在使用不同的色譜柱，或者使用不同的儀器進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得的結(jié)果基本一致，且供試品溶液穩(wěn)定性較好，表明該方法具有較好的耐用性。

2.4 含量限度的制定

采用以上檢測(cè)方法，對(duì)11批次的神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏樣品及參照藥分別測(cè)定含量，結(jié)果見表3。

綜合樣品含量測(cè)定的結(jié)果，考慮廠家實(shí)際生產(chǎn)情況，含量限度按以上11批樣品的含量分布情況擬定，根據(jù)神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏的規(guī)格9.5 cm×11.6 cm與新增加的規(guī)格7 cm×10 cm兩者面積大小的不同，按膏藥片的面積計(jì)算，神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏中馬錢子中士的寧的限量檢測(cè)暫擬訂為：本品每100平方厘米含馬錢子以士的寧（C21H22N2O2）計(jì)算為0.20～1.00 mg。

3 討論

馬錢子藥用歷史悠久，具有興奮中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血栓、強(qiáng)心、改善血液微循環(huán)等藥理作用。其味苦，性溫，有大毒。馬錢子主要含生物堿類、苷類、酸類、醇類等化學(xué)成分[9-10]，其中含生物堿1.5%～5%，生物堿類主要成分為士的寧，其主要成分既是有效成分也是毒性成分。故以士的寧為檢測(cè)指標(biāo)[7]。

采用本文所建立的方法，峰形對(duì)稱且穩(wěn)定，和相鄰雜質(zhì)峰分離較好，空白溶劑和空白輔料對(duì)本法無(wú)干擾，選用不同色譜柱和不同儀器測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果一致，均能達(dá)到試驗(yàn)要求，表明系統(tǒng)適用性較好。本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，樣品溶液穩(wěn)定，可作為神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏中士的寧含量測(cè)定方法。所確定的控制標(biāo)準(zhǔn)在保證用藥安全有效的前提下，參考了相同品種的水平，也兼顧到了生產(chǎn)實(shí)際，是確實(shí)可行的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：130.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：50-51.

[3]林振洪，王其新.神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏的薄層色譜鑒別[J].中藥材，1998，21（7）：373-374.

[4]吳洪，韋哲，郭勝.神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏治療急性軟組織損傷88例療效觀察[J].新中醫(yī)，2007，39（9）：57-58.

[5]梁曉東，陳濤，曹永倉(cāng)，等.馬錢子配伍白術(shù)前后對(duì)大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（1）：235-238.

[6]李哲，熊維政，李磊，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選神農(nóng)鎮(zhèn)痛膏醇提工藝[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，30（11）：1647-1649.

[7]劉學(xué)敏，王曉明，趙金玲，等.馬錢子的化學(xué)成分和藥理作用研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，32（14）：52-53.

[8]吳小娟，馬鳳森，鄭高利.馬錢子吲哚類生物堿毒性研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2016，32（6）：231-235.

[9]劉錫葵，李薇.馬錢子果化學(xué)成分研究[J].中草藥，1998，29（7）：435-438.

[10]解寶仙，唐文照，王利紅，等.馬錢子化學(xué)成分研究[J].中藥材，2016，39（1）：86-89.

[11]王丹丹，李俊松，蔡寶昌.HPLC法同時(shí)測(cè)定制馬錢子中4種生物堿類成分的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（6）：523-524.

[12]張加余，張倩，張凡，等.HPLC-ESI-MS-MS鑒定馬錢子中4類生物堿成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（9）：147-151.

[13]吳小娟，馬鳳森，喻炎.馬錢子堿和士的寧的硅膠柱色譜與半制備高效液相色譜法聯(lián)用分離純化[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2016，27（9）：2145-2147.

[14]王雪，金朗，王炳強(qiáng).HPLC法測(cè)定接骨丸中馬錢子士的寧含量[J].河南中醫(yī)，2016，36（6）：1102-1104.

[15]婁玉霞.反相高效液相色譜法測(cè)定桂枝馬錢片中士的寧和馬錢子堿的含量[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（12）：42-44，69.

（收稿日期：2017-04-01 本文編輯：許俊琴）