雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位對大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激RAW264.7免疫細胞氧化應激的調節作用

陳海蘭++蒙西南++趙尉丹+付遠妨+韋雅妮++胡庭俊

摘要：通過觀察雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位（FEA）預處理和后處理對大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激RAW264.7細胞所致氧化應激的影響，探討其抗應激活性。試驗將細胞分為空白對照組、LPS刺激組、LPS+陽性藥物組（維生素C）、LPS+不同濃度FEA組（25、50、100、200 μg/mL）。試驗1的細胞先用藥物預處理12 h，再用LPS進行刺激；試驗2則先用LPS刺激2 h后，再用藥物進行處理。分別采用Griess法和熒光探針法檢測NO分泌和活性氧（ROS）水平。結果發現，FEA預處理和后處理均能顯著抑制LPS刺激引起的NO和ROS水平的升高（P<0.05），且后處理效果更明顯。因此，FEA具有良好的抗氧化應激活性，且作為治療藥物比作為預防藥物效果更佳。

關鍵詞：雞血藤總黃酮；乙酸乙酯部位；脂多糖；氧化應激；免疫細胞

中圖分類號： R285.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0154-03

近年來，我國規模化養殖迅猛發展，在給畜牧養殖業帶來革命性變化的同時，畜禽應激綜合征的問題也開始顯現。飼養管理、環境變化、飼料營養、免疫治療和運輸等均會使動物產生應激，引起氧化損傷[1]。大量研究表明，氧化應激可導致動物采食量下降、生長發育和抗病力降低、死亡率增高，并顯著降低畜產品品質[1]。因此，如何預防或降低規模化養殖中畜禽的應激反應具有重要意義。

雞血藤為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤莖，分布于廣西、云南、廣東、貴州、福建等地區，主產于廣西，以廣西產者為道地藥材[2]。黃酮類化合物是雞血藤的主要活性成分，主要包括異黃酮類、異黃烷類、二氫黃酮類、花青素類、查爾酮類等[3-4]。雞血藤總黃酮可依次采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑進行萃取分離，研究發現乙酸乙酯萃取物中黃酮化合物的含量最高[5]。雞血藤具有活血補血、調經止痛、抗炎、抗氧化、免疫調節、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[6-9]?，F代藥理學研究發現，雞血藤總黃酮具有很強的自由基清除作用，可有效抑制Fenton體系誘導的大鼠心、肝、腎丙二醛（MDA）生成，抑制H2O2誘發的大鼠紅細胞氧化溶血，通過清除·OH、O2-及H2O2發揮抗氧化作用。雞血藤黃酮的強抗氧能力，使它在消除氧化應激、增強機體免疫力、提高抗病能力方面有很大的應用潛能。然而，目前國內外對雞血藤黃酮抗氧化能力的研究多集中在雞血藤的提取物上，并以體外清除自由基能力檢測為主，而對雞血藤進一步純化產物及在細胞水平上的研究還比較少。

本試驗采用乙醇提取法從廣西產雞血藤中得到雞血藤總黃酮，通過有機溶劑萃取法對其進行初步分離，經濃縮干燥后得到雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位（FEA），然后對FEA的細胞毒性及其預處理、后處理對大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激RAW264.7細胞所致氧化應激的影響，探討其細胞安全性及抗應激活性，為雞血藤的進一步開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗細胞小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2藥品與試劑雞血藤飲片，購自南寧市中堯路中藥材市場，產地為廣西崇左市，經廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室鑒定為雞血藤正品。藥材飲片經粉碎成中細粉后（過4號篩），采用乙醇提取法，以50%乙醇溶液為溶劑，在 1 g ∶30 mL 料液比和80 ℃條件下提取3 h。提取液經過濾、濃縮、初步純化后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，并對乙酸乙酯萃取液通過旋轉蒸發去除有機溶劑得到棕黃色粉末，即為雞血藤黃酮乙酸乙酯部位（FEA）。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、維生素C（VC）、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、大腸桿菌脂多糖（LPS）、亞硝酸鈉（NaNO2）、萘乙烯二胺和對氨基苯磺酸，均購自美國Sigma公司，胎牛血清（FBS）、DMEM培養液、青鏈霉素（PS），均購自Gibco公司。

1.2試驗內容與方法

1.2.1FEA的細胞毒性研究將對數生長期的RAW264.7細胞以1×105個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔。37 ℃、5% CO2培養箱培養過夜后，棄去上清液，每孔加入 90 μL 新鮮培養液和10 μL不同濃度的FEA溶液，使其終濃度為50、100、200、400、800 μg/mL。同時設對照組，加入 90 μL 新鮮培養液和10 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。每個處理設4個重復。繼續培養72 h后，棄去含藥培養液，每孔加入90 μL新鮮培養液和10 mL MTT儲存液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，每孔加入100 μL MTT結晶溶解液[10%十二烷基硫酸鈉（SDS），10 mmol/L HCl]，37 ℃孵育過夜，使紫色結晶充分溶解，用多功能酶標儀檢測D595 nm，并根據以下公式計算細胞相對活性：

細胞相對活性=D試驗-D空白1D對照-D空白×100%。

1.2.2FEA預處理對LPS刺激免疫細胞氧化應激的作用取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×105 個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔，并分為對照組、LPS組、VC100組、FEA25組、FEA50組、FEA100組和FEA200組，每個處理組設4個重復。37 ℃、5% CO2培養箱培養過夜后，棄去上清液，對照組每孔加入90 μL新鮮培養液和10 μL PBS，VC100組每孔加入90 μL新鮮培養液和10 μL 1 000 μg/mL VC溶液，FEA25～FEA200組每孔分別加入100 μL終濃度為25、50、100、200 μg/mL 的FEA溶液。藥物處理12 h后，棄去上清液，除對照組外，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS溶液。刺激2 h后，棄去含LPS培養液，換新鮮培養液（100 μL/孔）繼續培養4 h后，檢測上清液中NO濃度及細胞中活性氧（reactive oxygen， 簡稱ROS）水平。

1.2.3FEA后處理對LPS刺激免疫細胞氧化應激的作用取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×105 個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔，分組方式同“1.2.2”節。37 ℃、5% CO2培養箱培養過夜后，棄去上清液，除對照組外，每孔加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液。刺激2 h后，棄去上清液，對照組每孔加入90 μL新鮮培養液和10 μL PBS，VC100組每孔加入90 μL新鮮培養液和10 μL 1 000 μg/mL VC溶液，FEA25～FEA200組每孔分別加入100 μL終濃度為25、50、100、200 μg/mL的FEA溶液。繼續培養8 h后，檢測上清液中NO濃度及細胞中ROS水平。

1.2.4NO濃度的檢測稱取6.9 mg NaNO2加入100 mL超純水中溶解，配成1 mmol/L的儲存液。用NaNO2儲存液配制濃度為100、80、60、40、20、0 μmol/L的標準稀釋液，各取 100 μL，加入100 μL Griess試劑（等體積混合的0.1%萘乙烯二胺和1%對氨基苯磺酸），振蕩，室溫避光反應10 min，于多功能酶標儀上檢測D550 nm，并以NaNO2濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線。

取100 μL細胞上清液，加入100 μL Griess試劑測定D550 nm作對照，并根據NaNO2標準曲線計算NO濃度。

1.2.5ROS水平的檢測棄去培養液，用PBS洗滌細胞3次，每孔加入50 μL 10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃、5% CO2孵育30 min，每10 min輕輕搖勻1次。孵育結束后，棄上清液，用PBS洗滌3次，于多功能酶標儀激發波長488、525 nm處檢測熒光強度。

1.3數據分析

試驗數據采用SPSS 21.0進行分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法，進行LSD組間比較，結果以“平均值±標準差”的形式表示。

2結果與分析

2.1細胞毒性作用研究

用不同濃度的FEA處理RAW264.7細胞后，利用MTT法檢測細胞活性以分析FEA的細胞毒性作用。由圖1可見，當FEA濃度≤200 μg/mL 時，細胞存活率均接近對照組；隨著FEA濃度的增大，細胞活性逐漸下降，當FEA濃度 ≥400 μg/mL 時，細胞活性顯著或極顯著低于對照組。因此，FEA的安全濃度范圍為0～200 μg/mL，在此范圍內對RAW264.7細胞的生長無不良影響。

2.2FEA預處理對LPS刺激免疫細胞氧化應激的作用

為了探討FEA對氧化應激的預防作用，RAW264.7細胞先用系列濃度的FEA處理12 h，然后用LPS刺激誘導氧化應激的產生，再對NO分泌水平和ROS水平進行分析。由圖2可知，LPS刺激4 h后，NO分泌水平有所升高，但是與對照組相比差異不顯著；與模型組（LPS）比較，FEA預處理可以降低NO分泌水平，且在25、200 μg/mL時，差異極顯著（P<001）。從圖3可以看出，LPS刺激后，RAW264.7細胞內的ROS水平顯著升高（P<0.05），而FEA預處理則可以顯著降低ROS水平，在FEA濃度為100 μg/mL時差異極顯著（P<0.01）。這些結果表明，FEA預處理對于預防LPS誘導的氧化應激具有一定的保護作用。

2.3FEA對LPS刺激免疫細胞氧化應激的作用

進一步研究FEA對LPS誘導RAW264.7細胞氧化應激

的治療作用。與預防試驗不同的是，本試驗先用LPS刺激RAW264.7細胞建立氧化應激模型，然后用不同濃度的FEA處理細胞，通過檢測NO、ROS水平的變化，分析其抗氧化應激作用。由圖4、圖5可知，LPS刺激RAW264.7細胞后，NO、ROS水平均極顯著升高（P<0.01），表明免疫細胞氧化應激模型已成功建立。相比于模型組，經VC或25～200 μg/mL的FEA處理后，NO水平均極顯著下降（P<0.01），且較高濃度的FEA（50～200 μg/mL）可同時顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）下調ROS水平。因此，FEA后處理對于LPS誘導產生的氧化應激具有良好的抑制作用，效果與對照藥物VC相當。

3討論與結論

氧化應激是指機體遭受各種有害刺激時，機體內的活潑分子如活性氧自由基（reactive oxygen free radicals）產生并堆積，超過了動物機體對過氧化物的清除能力，致使機體的氧化系統和抗氧化系統失衡[10]?；钚匝跏呛醒醴肿拥淖杂苫?，包括超氧陰離子（ O-2· ）、過氧化氫（H2O2）、次氯酸離子（OCl-）和一氧化氮（NO）。ROS含有的不成對電子使其具有很強的反應活性，極易攻擊DNA、脂質、蛋白質等生物分子，造成機體組織的氧化損傷，加速機體的衰老，引發炎癥，導致各種慢性疾病的發生[11-12]。當機體受到刺激時，細胞內成分轉移至細胞膜的內表面，形成具有NADPH氧化酶活性的完全活性酶復合物，進而催化ROS的生成[13]。脂多糖是介導系統性炎癥反應綜合征的主要啟動因子，它可激活單核細胞和巨噬細胞，引起NO和炎性細胞因子的合成與釋放，進而導致機體一系列炎癥反應的發生和發展[14-15]。

本試驗中，首先通過MTT法研究了FEA的細胞毒性作用，發現其細胞毒性較低，在≤200 μg/mL范圍內對RAW264.7細胞的生長無明顯不良影響。然后，通過預防試驗和治療試驗探討了FEA的抗氧化應激活性。研究發現，LPS刺激RAW264.7細胞后，NO、ROS水平明顯上升，提示氧化應激的發生。FEA預處理和后處理，基本能不同程度抑制LPS刺激引起的NO和ROS產生，表明FEA能夠改善RAW264.7細胞氧化應激損傷，與黃酮類化合物較強的自由基清除能力和抗氧化能力相關，并與黃酮類化合物可通過抑制炎癥因子（NO、TNF-α等）的釋放降低細胞氧化損傷的報道[16-17]相一致。另外，相比于藥物預處理（預防試驗），先造成氧化應激再用藥物處理（治療試驗），FEA的作用更加明顯。治療試驗中，NO、ROS水平均顯著或極顯著低于LPS刺激組（P<0.05或P<0.01），表明在抗應激反應中，FEA更適宜作為治療藥物使用。

綜上所述，本試驗先通過MTT法檢測了FEA的細胞毒性，然后通過分析FEA預處理或后處理對LPS刺激RAW264.7細胞NO、ROS分泌水平的影響，探討了其抗氧化應激作用。試驗觀察到FEA在0～200 μg/mL濃度內對RAW264.7細胞的生長無明顯不良影響，能顯著或極顯著抑制LPS誘導的氧化應激反應，且后處理比預處理細胞對LPS誘導應激反應的抑制作用更明顯，表明FEA更適合作為治療藥物用于抵抗氧化應激反應。

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