CBA技術在菌陰結核病診斷中的運用研究

劉 君，裴 豪，王 俊，戴亞萍，翟樺梓，陳玉梅

(無錫市第五人民醫院，江蘇 無錫214005)

CBA技術在菌陰結核病診斷中的運用研究

劉 君，裴 豪*，王 俊，戴亞萍，翟樺梓，陳玉梅

(無錫市第五人民醫院，江蘇 無錫214005)

目的 評價CBA檢測經特異抗原刺激后PBMC上清液中細胞因子濃度水平在菌陰結核病中的診斷價值。方法 將研究對象分為健康人群、肺炎患者、潛伏感染者和菌陰結核病患者四組，運用CBA技術對PBMC刺激培養后的上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g和IL-17的濃度進行檢測，并對檢測結果統計分析。結果 菌陰結核病患者的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g分泌水平均高于健康人群和肺炎患者組，差異有統計學意義；IL-4和IL-17無差異。 菌陰結核病患者組的IL-2低于潛伏感染組，差異有統計學意義；TNF-a、IFN-g均高于潛伏感染組，差異有統計學意義；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17結果差異無統計學意義。結論 CBA對PBMC刺激后上清液的細胞因子檢測結果能為菌陰結核病的診斷提供有效的依據，對于控制結核病疫情的發展，并實現最終消滅結核病的長遠目標具有極其重要的意義。

菌陰肺結核；CBA技術；細胞因子檢測

(ChinJLabDiagn,2017,21:0983)

結核病是目前威脅全球公共衛生的主要傳染病之一，全球有近三分之一人感染過結核病[1]。我國結核病的流行形勢非常嚴峻，被世界衛生組織列為結核病高負擔的國家之一[2]。早發現早治療被認為是控制結核病流行最好的方法，但是由于大部分菌陰肺結核患者沒有明確的細菌學證據，診斷十分困難，這將加大我國結核病流行控制的壓力。有效的菌陰肺結核診斷技術已成為當前結核病控制的難點和熱點[3]。本研究運用CBA技術對經過特異性抗原刺激后單個核細胞培養上清液中多個細胞因子的變化進行檢測，統計并分析結果以探討CBA技術在菌陰結核病診斷中的運用價值，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 本實驗將研究對象分為4組：其中菌陰肺結核患者和肺炎患者來自無錫市第五人民醫院2015年1月至12月收治的住院患者，健康人群和潛伏感染者來自本院體檢中心的體檢人群。菌陰肺結核組共57人(男30人、女27人)，平均年齡33.46±8.43歲；肺炎患者組30人(男16人、女14人)，平均年齡34.27±10.00歲；潛伏感染組40人(男18人、女22人)，平均年齡33.25±9.59歲；健康對照32人(男15人、女17人)，平均年齡32.47±11.27歲。以上所有研究對象均排除HIV感染、無糖尿病、無妊娠、無合并其他影響檢測指標的疾病。

1.1.2 儀器和試劑 FC500型流式細胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司、SW-CJ-2FD型凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司、ST-16型細胞離心機和HERAcell 150i二氧化碳培養箱購自Thermo Scientific有限公司、Th1/ Th2/ Th17細胞因子檢測試劑盒購自美國BD有限公司，CFP-10、ESAT-6抗原蛋白購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集和培養 于檢測當天早上用肝素抗凝管采集患者空腹靜脈血5 ml，加入Ficoll分離液分離單個核細胞懸液(PBMC)，用細胞培養液配置成25萬細胞/ml的標準溶液。取出微量板，在檢測孔中加入50 μl的CFP-10、ESAT-6抗原蛋白混合溶液，陰性孔中加入50 μl的細胞培養液，陽性對照孔中加入50 μl的植物血凝素，然后再每孔加入100 μl配置好的細胞標準溶液，混勻后置于CO2培養箱中37℃培養過夜。

1.2.2 細胞因子的檢測 取出培養過夜后的微量板離心，取50 μl上清液放入流式檢測管，加入50 μl PE檢測試劑和50 μl細胞因子捕獲微球混合液，混勻后室溫避光保存3 h。加入1 ml洗液，200 g離心5 min，棄上清，每管加入300 μl洗液，混勻后立即上機檢測。

1.2.3 菌陰結核病診斷標準

3次痰涂片及1次培養陰性的肺結核患者。具備下列1-6中3項或7-8項中任何1項可入選。

①典型肺結核臨床癥狀和胸部X線表現；

②抗結核治療有效；

③臨床可排除其他非結核性肺部疾患；

④PPD(5TU)強陽性，血清抗結核抗體陽性；

⑤痰結核菌PCR+探針檢測呈陽性；

⑥肺外組織病理證實結核病變；

⑦支氣管肺泡灌洗液檢查(BALF)檢出抗酸分枝桿菌；

⑧支氣管或肺部組織病理證實結核病變。

1.3 統計學方法 利用SPSS18.0軟件對檢測數據進行統計學分析。各組人群間的數據分析采用獨立樣本T檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌陰肺結核患者與健康人群的檢測結果比較

菌陰結核病患者的特異性抗原刺激后PBMC分泌的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于健康人群，差異有統計學意義；IL-4和IL-17結果都為0，無差異，見表1。

表1 菌陰肺結核患者與健康人群各細胞因子的比較

2.2 菌陰肺結核患者與肺炎患者的檢測結果比較

菌陰結核病患者組的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于肺炎患者組，差異有統計學意義；IL-4和IL-17結果都為0，無差異，見表2。

2.3 菌陰肺結核患者與潛伏感染者的檢測結果比較

菌陰結核病患者組的IL-2低于潛伏感染組，差異有統計學意義；TNF-a、IFN-g均高于潛伏感染組，差異有統計學意義；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17結果差異無統計學意義，見表3。

表2 菌陰肺結核患者與肺炎患者組各細胞因子的比較

表3 菌陰肺結核患者與潛伏感染組各細胞因子的比較

3 討論

目前，全世界已有近20億人口受到結核分枝桿菌(Mycobacterium ruberculosis,Mtb)的感染，結核患者約2000萬人[4]。根據世界衛生組織的統計，2011年約新發結核病870萬，死亡140萬人[1]。目前我國結核病年發病人數約為130 萬，占全球發病的14.9%，位居全球第2位，活動性肺結核的患病率459/10萬，其中約50%-70%為菌陰肺結核[5]。菌陰肺結核是指以痰涂片和培養法(3次涂片一次培養)查分枝桿菌均為陰性的活動性肺結核。但是“涂陰”并非是真正的不排菌，菌陰肺結核如不能早期診斷，近一半將發展為涂陽患者，成為新的傳染源。目前診斷肺結核的主要方法是痰涂片染色鏡檢、X線胸片檢查(缺乏特異性)、結核菌素皮膚試驗(TST)，繼而以改良羅氏固體培養基培養確診。然而，針對菌陰肺結核涂片鏡檢、分離培養結核桿菌對臨床診斷意義不大。因此，如有一項針對菌陰結核病檢測的快速有效的診斷技術，將給目前治療和控制結核病的流行帶來巨大的幫助。

本研究所使用的流式液相多重蛋白定量技術(Cytometric Bead Array，CBA),是基于流式細胞檢測系統的多重蛋白定量技術，其能夠對單個樣品中的多個細胞因子指標同時進行檢測。相比于傳統的可溶性蛋白檢測定量方法，CBA具有更低的檢測下限。應用少量的樣本，即可對所檢測的樣本中的多種可溶性細胞因子同時進行檢測[6,7]。通過CBA對經ESAT-6、CFP-10抗原肽刺激的PBMC上清液中細胞因子的檢測，我們發現菌陰肺結核患者組的TNF-a和IFN-g這兩個細胞因子水平較其他3組都要高，且差異都具有顯著的統計學意義(P<0.01)；IL-2的濃度均比健康人群和肺炎患者組高，但低于潛伏感染者組，差異有統計學意義；IL-6和IL-10的濃度高于健康人群和肺炎患者組，差異有統計學意義，與潛伏感染者組的濃度相當，無統計學差異。從上述數據中可以發現，結核病感染人群(包括潛伏感染組和菌陰肺結核患者組)的IL-2、TNF-a和IFN-g的濃度比其他人群高出很多，這3個細胞因子可以作為區分的主要指標。在潛伏感染組和菌陰肺結核患者組中，前者IL-2的濃度較高，后者IFN-g和TNF-a的濃度較高，且差異都有統計學意義，可以有效的區分這兩組人群。因此，我們認為利用CBA技術同時檢測經特異性抗原刺激后的PBMC上清液中IL-2、TNF-a和IFN-g的濃度，能為菌陰肺結核的診斷提供可靠的證據。

綜上所述，由于現有針對菌陰肺結核現有診斷技術及方法都存在一定的局限性[8]。因此對新型診斷技術的研發是現階段結核病研究的主要目標。本研究發現通過特異性抗原刺激外周血單個核細胞，運用CBA技術檢測上清液中IFN-g、IL-2、TNF-a、IL-4、IL-10、IL-6、IL-17等細胞因子的分泌情況，能為菌陰結核病的診斷提供有效的依據，這對于提高我國結核病的診斷水平，及時發現、治療、管理傳染源，控制其傳播流行，降低其對周圍人群的危害具有積極的推動作用，對于控制結核病疫情的發展，并實現最終消滅結核病的長遠目標具有極其重要的意義。

[1]World Health Organization.Global tuberculosis report 2012 [M].Geneva:World Health Organization,2012:8.

[2]Russell DG,Barry CE,Flynn JL.Tuberculosis:what we don't know can,and does,hurt us[J].Science,2010,328(5980):852.

[3]唐文芳,劉日輝,張亞男,等.結核性胸膜炎患者血清IFN-γ表達的meta分析[J].中國實驗診斷學,2014,08:1278.

[4]Jones DA,Guha K,Ho TB.Notification of tuberculosis in an area of low TB incidence[J].Clin Med，2008，8:637.

[5]高愛忠.兩種試驗對菌陰肺結核診斷價值的比較[J].臨床肺科雜志，2015，20(3)：432.

[6]Elshal MF,McCoy JP.Multiplex bead array assays:performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA[J].Method，2006，38:317.

[7]Morgan E,Varro R,Seoulvede H,et al.Cytometric bead array:a multiplexed assay platform with application in various areas of biology[J].Clin Immunol，2004，110:252.

[8]Harari A,Rozot V,Enders FB,et al.Dominant TNF-α+ Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+ T cell responses discriminate between latent infection and active disease[J].Nat Med,2011，17(3):372.

The research of using CBA technology in the diagnosis about smear negative TB patients

LIUJun,PEIHao,WANGJun,etal.

(WuxiNo’5People’sHospital,Wuxi214005,China)

Objective To evaluate the value of CBA technology in smear negative tuberculosis diagnosis by detecting PBMC supernatants cytokine levels which stimulation by specific antigen.Methods The subjects were divided into healthy people,pneumonia patients,tuberculosis latent infection and smear-negative TB patients.To detected IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-a,IFN-g and IL-17 in PBMC culture supernatants after specific antigen stimulation by CBA technology,then statistical analysis the test results. Results The IL-2,IL-6,IL-10,TNF-a and IFN-g secretion levels of smear-negative TB patients were higher than those of both healthy people and pneumonia patients,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4 and IL-17 were no difference.The concentration of IL-2 of smear-negative TB patients was lower than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of TNF-a and IFN-g were higher than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4,IL-6,IL-10 and IL-17 were no difference.Conclusion The results of cytokine test in PBMC supernatants after stimulation could provide the diagnosis of smear-negative TB patients an effective basis,had great significance to control the development of TB epidemic and achieve the eventually goals of eliminate TB.

smear-negative TB patient;CBA technology;cytokines

江蘇省自然科學基金面上研究項目(BK20151113)；無錫市醫管中心面上項目(YGZXM1523)；無錫市第二輪公共衛生“三名戰略”優秀青年人才培養經費資助

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0983-04

R524

A

劉君，男，32歲，碩士，主管技師，研究方向：結核病的快速診斷。

2016-12-11)