梨花熊果苷提取工藝及體外抗氧化性初步研究

付士慧，朱文學(xué)

梨花熊果苷提取工藝及體外抗氧化性初步研究

付士慧，朱文學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023)

為了提高梨花熊果苷提取率，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率和超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比63 mL/g、超聲功率271 W和超聲時(shí)間50 min時(shí)，梨花熊果苷的提取率達(dá)到最大，為2.575 3%。梨花熊果苷提取液對(duì)羥基自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

梨花;熊果苷;超聲;二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì);抗氧化性

0 引言

梨花為薔薇科梨屬植物梨樹的花序。據(jù)明朝《本草通玄》和《本草綱目》記載，梨花有潤(rùn)肺、化痰和止咳等功效［1－2］。梨花富含多酚類物質(zhì)，主要的功能性成分為熊果苷。熊果苷具有平咳止喘、清肺利尿的作用，在烏飯樹、越橘和梨樹中均有檢出［3］。文獻(xiàn)［4］采用高效液相色譜法，得出了9種梨花中熊果苷與鮮梨花的質(zhì)量比為3.5～35.7 mg/g。每年因疏花疏果和生產(chǎn)梨花粉而丟棄的大量梨花都可以作為提取熊果苷的天然原料，進(jìn)行資源利用。

超聲波的機(jī)械振動(dòng)能促使植物中的功能成分溶出和擴(kuò)散［5］，在超聲傳播過程中產(chǎn)生空穴作用，釋放出大量能量，瞬時(shí)達(dá)到高溫高壓的狀態(tài)，破解植物細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)含物可以和溶劑完全接觸，增加有效成分的提取率。文獻(xiàn)［6］采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取咖啡酰熊果苷的工藝，文獻(xiàn)［7］研究了超聲輔助提取黃玉米中粗類黃酮的最佳提取工藝及其抗氧化作用，但目前尚未有梨花中熊果苷提取的相關(guān)報(bào)道。因此，本文對(duì)超聲輔助提取梨花熊果苷進(jìn)行了研究，并進(jìn)行了梨花熊果苷提取液清除羥自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其抗氧化能力，為梨花熊果苷資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨花:豆梨(Pyrus calleryana Decne.)樹開的花，采集于河南省洛陽市孟津縣某梨園。選取色澤鮮亮、新鮮飽滿、無機(jī)械損傷和病蟲害的梨花，置于熱泵45℃干燥至恒質(zhì)量，粉碎過40目篩后備用。

試劑:熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)KM0530CA14)。無水乙醇、硫酸亞鐵、抗壞血酸(VC)、水楊酸、DPPH和過氧化氫均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;UV2400型紫外-可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;高速粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本文標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制基于文獻(xiàn)［8］的方法并略有改動(dòng)。精確稱取熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，于棕色容量瓶中用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別取0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、30 mL的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液于100 mL棕色容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液定容至100 mL。然后選定熊果苷的最大吸收波長(zhǎng)282 nm，在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度。以熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為X軸，吸光度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程Y=11.071X+0.008 5，測(cè)得相關(guān)度R2=0.997 8。

1.3.2 梨花熊果苷的提取

工藝流程:梨花粉末→加入乙醇溶液→超聲輔助提取→過濾→定容→測(cè)定熊果苷質(zhì)量濃度。操作方法:對(duì)文獻(xiàn)［9］的方法略有改動(dòng)。熊果苷提取率計(jì)算公式為:

其中:ρ為提取液熊果苷質(zhì)量濃度，g/L;V0為定容后的提取液體積，L;V1為量取定容的提取液體積，L;

V2為量取測(cè)定的提取液體積，L;m為梨花粉末的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)X1(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比X2(乙醇溶液體積/梨花粉末質(zhì)量，30 mL/g、40 mL/g、50 mL/g、60 mL/g、70 mL/g)、超聲功率X3(200 W、250 W、300 W、350 W、400 W)和超聲時(shí)間X4(30 min、40 min、50 min、60 min、70 min)為自變量，以梨花熊果苷提取率為因變量，分析4個(gè)因素對(duì)梨花熊果苷提取率的影響。

1.3.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化梨花熊果苷的提取工藝

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，研究各因素交互作用［10］對(duì)梨花熊果苷提取率的影響。

1.3.5 梨花熊果苷清除羥基自由基的能力

［11－12］的方法并略有改動(dòng)，羥基自由基清除率計(jì)算公式為:

其中:A0為蒸餾水的吸光度;A2為加入過氧化氫溶液的樣品吸光度;A1為不加入過氧化氫溶液的樣品吸光度。

1.3.6 梨花熊果苷清除DPPH自由基的能力

根據(jù)文獻(xiàn)［13－14］的方法，DPPH自由基清除率計(jì)算公式為:

其中:A0為DPPH甲醇溶液的吸光度;A1為樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)梨花熊果苷提取率的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時(shí)，梨花熊果苷提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，梨花熊果苷提取率隨其增加而降低。這可能是由于植物體內(nèi)的熊果苷等水溶性多酚在細(xì)胞的液泡中存在［15］，而非水溶性的多酚類分布在細(xì)胞壁上，且其中大部分以氫鍵方式與蛋白質(zhì)或者多糖類物質(zhì)結(jié)合。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，植物細(xì)胞的溶脹程度也不斷增加［16］，更利于提取溶劑穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，一方面，提取溶劑極性迅速下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，對(duì)多酚類物質(zhì)的傳質(zhì)產(chǎn)生阻礙作用;另一方面，一些醇溶性雜質(zhì)、色素及脂溶性雜質(zhì)不斷溶出，與脂溶性熊果苷競(jìng)爭(zhēng)提取溶劑，從而導(dǎo)致溶出熊果苷的量減少，提取率降低。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.2 液料比對(duì)梨花熊果苷提取率的影響

當(dāng)液料比為30～60 mL/g時(shí)，梨花熊果苷提取率隨液料比的增加而增加，但當(dāng)液料比超過60 mL/g時(shí)提取率隨其增加而降低。這可能是由于有機(jī)溶劑會(huì)使梨花中酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)合鍵斷裂［17］，幫助熊果苷不斷溶出。因此，當(dāng)乙醇溶劑量較少時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的濃度差較大，有利于乙醇快速滲透到細(xì)胞內(nèi)部，熊果苷的浸出量增大，提取率逐漸增大。但當(dāng)液料比超過60 mL/g時(shí)，由于超聲波的能量被溶劑吸收、擴(kuò)散，阻礙了熊果苷的溶出，提取率呈下降趨勢(shì)。考慮到液料比過高會(huì)浪費(fèi)原料和試劑，增加成本和后續(xù)工作量，因此，選擇液料比為60 mL/g。

2.1.3 超聲功率對(duì)梨花熊果苷提取率的影響

當(dāng)超聲功率為200～250 W時(shí)，梨花熊果苷的提取率隨超聲功率的增加而增加，但當(dāng)超聲功率超過250 W時(shí)提取率隨其增加而降低。這可能是由于熊果苷這類次生代謝產(chǎn)物分布在細(xì)胞膜內(nèi)，而超聲波具有機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞［18］，使得熊果苷更容易溶出。超聲功率越大，破壞物料組織的細(xì)胞壁程度越大，熊果苷溶出得越充分。但超聲功率過大會(huì)加劇分子運(yùn)動(dòng)，同時(shí)溶液會(huì)聚集超聲產(chǎn)生的大量熱量［19］，對(duì)熊果苷分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇超聲功率為250 W。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)梨花熊果苷提取率的影響

當(dāng)超聲時(shí)間為30～50 min時(shí)，梨花熊果苷提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加，但當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min時(shí)，提取率隨其增加而降低。這可能是由于在超聲的輔助下，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，增大了溶劑與物料的接觸面積，有助于熊果苷的溶出。然而由于超聲具有機(jī)械效應(yīng)，隨著時(shí)間的增加，溶劑溫度不斷升高，而熊果苷是熱敏性物質(zhì)，極易氧化分解產(chǎn)生對(duì)二苯酚和葡萄糖。同時(shí)，隨著溫度的升高，酶的活性增強(qiáng)，熊果苷氧化程度加劇，隨著超聲時(shí)間的增加，其他雜質(zhì)也不斷溶出［20］，從而導(dǎo)致熊果苷的提取率逐漸下降。因此，選擇超聲時(shí)間為50 min。

2.2 梨花熊果苷提取的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)31個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，對(duì)模型Y=f(X1，X2，X3，X4)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表F1=3.45，P＞0.05，說明該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)相關(guān)性和擬合性較好。因此，該模型可用于超聲輔助提取梨花中熊果苷的分析和預(yù)測(cè)。

表1 方差分析結(jié)果

圖1 梨花熊果苷提取率響應(yīng)面

2.2.2 交互作用分析

圖1為梨花熊果苷提取率響應(yīng)面。由圖1可知:X1和X2的相互作用對(duì)指標(biāo)值影響較大，梨花熊果苷提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為52%～70%、液料比為55～70 mL/g時(shí)較高。這可能是由于溶質(zhì)質(zhì)量濃度受到液料比的影響。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際操作的可行性，將最佳提取條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比63 mL/g、超聲功率271 W、超聲時(shí)間50 min，重復(fù)試驗(yàn)6次得到熊果苷提取率的均值為(2.575 3±0.145 3)%，比理論預(yù)測(cè)值誤差絕對(duì)值低2%，說明此模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 梨花熊果苷抗氧化活性分析

2.3.1 羥基自由基清除效果

圖2為梨花熊果苷及對(duì)照品抗壞血酸(VC)對(duì)羥基自由基的清除效果。由圖2可知:梨花熊果苷樣品和VC對(duì)羥基自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的升高均持續(xù)增加。在質(zhì)量濃度較低時(shí)，梨花熊果苷提取液清除羥基自由基的作用略低于VC，但當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL后，梨花熊果苷提取液對(duì)羥基自由基的清除能力明顯小于VC。在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，梨花熊果苷提取液清除羥基自由基的能力達(dá)到最大，為38%。

2.3.2 DPPH自由基清除效果

圖3為梨花熊果苷及對(duì)照品VC對(duì)DPPH自由基的清除效果。由圖3可知:梨花熊果苷樣品和VC對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的升高均持續(xù)增加。在質(zhì)量濃度較小時(shí)，梨花熊果苷提取液的清除率幾乎等同于VC，而當(dāng)質(zhì)量濃度較大時(shí)，梨花熊果苷提取液的清除率低于VC。梨花熊果苷提取液具有一定的抗氧化能力，但對(duì)DPPH自由基的清除效果差于VC。

圖2 梨花熊果苷及VC對(duì)羥基自由基的清除效果

圖3 梨花熊果苷及VC對(duì)DPPH自由基的清除效果

3 結(jié)論

(1)超聲輔助提取梨花熊果苷最佳工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比63 mL/g、超聲功率271 W、超聲時(shí)間50 min，此時(shí)梨花中熊果苷提取率為(2.575 3±0.145 3)%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致。

(2)梨花熊果苷具有較強(qiáng)的清除羥基自由基和DPPH自由基的能力。在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，梨花熊果苷提取液清除羥基自由基和DPPH自由基的能力均隨其質(zhì)量濃度的增加而增加。

參考文獻(xiàn):

［1］李中梓.李中梓醫(yī)學(xué)全書［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2008.

［2］朱保華.名醫(yī)李時(shí)珍與《本草綱目》［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998.

［3］李曉嬌，劉憶明.α-熊果苷合成研究進(jìn)展［J］.保山學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，33(2):18－21.

［4］李媛，喬進(jìn)春，張玉星，等.梨花中熊果苷的高效液相色譜分析［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(1):76－78，83.

［5］陳紅梅，謝翎.響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析［J］.食品科學(xué)，2016，37(2):45－50.

［6］李娜，但漢龍，劉云，等.雀嘴茶咖啡酰熊果苷水提工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2015，36(17):182－186.

［7］楊文平，李云，郝教敏，等.黃玉米粗類黃酮提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化及其體外抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2015，36(20):62－66.

［8］張海豐，孫健，滕坤.紫景天中熊果苷的含量測(cè)定［J］.中國(guó)藥物警戒，2011，8(6):321－323.

［9］羅磊，張冰潔，朱文學(xué)，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取金銀花葉黃酮工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2016，37(6):13－19.

［10］袁志發(fā)，周靜芋.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［11］劉水英，李新生，黨婭，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥花青苷提取工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2014，35(22): 84－91.

［12］殷軍，葛青，毛建衛(wèi)，等.竹葉多糖的組分及抗氧化活性分析［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(2):100－103.

［13］朱艷華，譚軍.玉米多肽抗氧化作用的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23(1):36－38.

［14］HATANO T，KAGAWA H，YASUHARA T，et al.Two new flavonoids and other constituents in licorice root:their relative astringency and radical scavenging effects［J］.Chemical＆pharmaceutical bulletin，1988，36(6):2090－2097.

［15］闕淼琳，蔣玉蓉，曹美麗，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化藜麥種子多酚提取工藝及其品種差異［J］.食品科學(xué)，2016，37(4): 7－12.

［16］鄧娜，喬沈，高芯，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化石榴皮多酚提取工藝及石榴不同部位多酚的抗氧化活性分析［J］.食品科學(xué)，2016，37(6):39－43.

［17］李次力，劉暢，劉天怡，等.馬鈴薯皮中綠原酸提取工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2014，35(12):70－74.

［18］喬孟，屈曉清，丁之恩.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取湖北海棠葉中總黃酮工藝［J］.食品科學(xué)，2013，34(2): 143－147.

［19］陸敏佳，蔣玉蓉，袁俊杰，等.藜麥葉片多酚最佳提取工藝及其抗氧化性研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2016，31(1): 101－106.

［20］JEON J S，KIM B H，LEE S H，et al.Simultaneous determination of arbutin and its decomposed product hydroquinone in whitening creams using high-performance liquid chromatography with photodiode array detection:effect of temperature and pH on decomposition［J］.International journal of cosmetic science，2015，37(6):567－573.

TS209

A

1672－6871(2017)05－0055－05

10.15926/j.cnki.issn1672－6871.2017.05.012

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171723)

付士慧(1993－)，女，江蘇灌南人，碩士生;朱文學(xué)(1967－)，男，通信作者，河南信陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏.

2017－01－03