清肺利氣通絡法中藥對哮喘模型大鼠肺組織白介素17表達的影響

趙久齡+王玉水+王欣

摘要：目的探討清肺利氣通絡法中藥對卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠肺組織白介素17（IL-17）表達的影響。方法40只雄性SD鼠隨機分為空白組、模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組，每組10 只?？瞻捉M不給予任何處理，其余3組動物均以OVA致敏和激發方案建立哮喘模型。模型組僅造模，不給予任何其他藥物處理；布地奈德組在每次霧化激發前1h給予布地奈德混懸液霧化吸入15min；清肺利氣通絡組在每次霧化激發前分別給予清肺利氣通絡顆粒灌胃。末次激發4 h后處死大鼠，取肺組織進行病理切片，HE染色觀察肺組織病理形態及免疫組化檢測IL-17的表達。結果HE染色鏡下顯示：與模型組比較，布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組的肺組織病理形態均有減輕。模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡組大鼠肺組織中IL-17平均光密度（OD）值均較空白組顯著增高（P<0.01）；布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值較模型組顯著降低（P<0.01）；布地奈德組與清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論以清肺利氣通絡法組方的清肺利氣通絡顆?？梢酝ㄟ^減輕哮喘大鼠肺組織IL-17的表達，改善肺組織病理形態，具有較好的效果，值得進一步深入研究。

關鍵詞：支氣管哮喘；清肺利氣通絡；白介素17；中藥

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）06-0018-05

【Abstract】Objective： To study the effect of Qingfei Liqi Tongluo （QLT） method on the expression of interleukin-17 in lung tissue of asthmatic rats induced by ovalbumin （OVA）. Methods： 40 male SD rats were randomly divided into a blank group， a model group， a budesonide group and a QLT granule group， 10 rats per group. The blank group was not treated with any drug and the other three groups of the rats were induced by OVA to sensitization and stimulation to establish asthma models. The model group was only modeled with no other drug. The budesonide group was given inhalation of budesonide suspension for 15 min at 1 hour after each atomization. The QLT group was administrated with QLT granule before each atomization. The rats were sacrificed 4 hours later at the last stimulation， and their lung tissue was taken for pathological sections. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining and the expression of IL-17 was detected by immunohistochemistry. Results： Compared with the model group， the histopathological changes of the lung tissue in the budesonide group and QLT granule group decreased under HE staining. The mean optical density （OD） of IL-17 in the model group， budesonide group and QLT group were significantly higher than those in blank group （P<0.01）. But the mean OD value of IL-17 in the lung tissue of the budesonide group and QLT granule group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）. There was no statistically significant difference （P>0.05） in the mean OD of IL-17 in the lung tissue of the rats between the budesonide group and QLT granule group. Conclusion： QLT granule can ruduce the expression of IL-17 in lung tissue of asthmatic rats and improve the pathological morphology of lung tissue， worthy of further study.

【Key words】bronchial asthma， Qingfei Qi Tongluo， interleukin 17， traditional Chinese medicine

哮喘，即支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，臨床上以反復發作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為主要表現[1-2]。兒童哮喘的發病率逐年增高，且易反復發作。臨床治療需要長期規范吸入糖皮質激素和支氣管擴張劑以及口服白三烯受體拮抗劑等，嚴重者甚至需要使用全身激素，影響兒童的身體和心理健康，也給家庭和社會帶來沉重負擔[3-4]。

哮喘的發病機制極為復雜，尚有許多機制仍不是很清楚。目前國內外研究表明：哮喘動物實驗及臨床患者的血清、肺泡灌洗液、痰液和肺組織中白介素17（IL-17）均可有不同程度的升高，提示IL-17在哮喘的發病中起到重要作用[5-8]。中醫藥治療哮喘取得了較多新的進展，筆者長期應用清肺利氣通絡法治療兒童哮喘，取得了滿意的療效。為了進一步探討其作用機制，建立卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠模型，評價以清肺利氣通絡法組方的清肺利氣通絡顆粒對哮喘大鼠肺組織IL-17表達的影響。

1材料

1.1實驗動物SPF級健康6周齡雄性SD大鼠40只，體重180～220 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號SCXK（軍）-2009-003，飼養于天津市南開醫院實驗動物中心。

1.2藥物實驗用清肺利氣通絡顆粒由炙麻黃、杏仁、生石膏、生甘草、浙貝母、地龍、紫蘇子和葶藶子組成，采用北京康仁堂藥業有限公司生產的中藥免煎配方顆粒配置而成，實驗前配置成濃度為2 g（生藥）/ml的蒸餾水混懸液；吸入用布地奈德混懸液（澳大利亞AstiaZeneca Pty Ltd.批號319722）。

1.3試劑材料卵清蛋白（OVA）（美國Sigma公司，批號A5503），氫氧化鋁Al（OH）3（分析純）（天津致遠化學試劑有限公司，批號2016072092），水合氯醛（上?；瘜W試劑公司，批號 20140825），0.9%生理鹽水（天津百特醫療用品有限公司，批號C1608017）兔抗大鼠IL-17抗體（美國AbSci公司，批號 6909），SP免疫組化染色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號 999098）及增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號 P4617）。

1.4儀器403E型空氣壓縮式霧化機（江蘇魚躍醫療設備有限公司），CX31 型光學生物顯微鏡（日本Olympus公司），BW3200S型電子天平及BL-220H型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），ASP200S全自動組織脫水機（德國Leica公司），EG1150C獨立冷臺-分體式石蠟包埋機（德國Leica 公司），RM2235切片機（德國Leica公司）。

2方法

2.1分組將40只SPF大鼠按照隨機數字表分為4組：空白組、模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組，每組均為10只?？瞻捉M不給予任何處理，其余3組動物均按照文獻方法[9]，以OVA致敏和激發方案建立哮喘模型：造模實驗的第0、7、14 d給予40 mg OVA+2 mg AI（OH）3+1 mL生理鹽水混懸液腹腔注射致敏；第21～27 d，分別將實驗動物置于1自制長方體密閉玻璃箱內，給予OVA和0.9%生理鹽水配置成的1% OVA 霧化激發建立哮喘模型，每日霧化1次，每次30 min。模型組僅造模，不給予任何其他藥物處理；布地奈德組在每次霧化激發前1 h給予布地奈德混懸液霧化吸入15 min；清肺利氣通絡顆粒組在每次霧化激發前分別給予清肺利氣通絡混懸液2 mL灌胃。末次激發4 h后取材。

2.2取材方法以5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定，開胸取新鮮雙肺組織，將左肺置于10%福爾馬林溶液固定，常規方法石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學檢測。

2.3肺組織HE染色大鼠肺組織于10%福爾馬林溶液固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備厚度4 μm的切片，貼片，恒溫箱烘干，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，每個樣本隨機選取5張切片，然后蘇木素染色、酸水及氨水分色，沖洗、梯度酒精脫水，入酒精伊紅染色，純酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

2.4免疫組化法檢測大鼠肺組織中IL-17的表達常規固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片，貼片，每個樣本隨機選取5張切片，脫蠟、復水。3% H2O2 20 min抗原修復，PBS清洗5 min×3，山羊血清封閉30 min，加一抗（以1：100 稀釋的兔抗大鼠IL-17），以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃冰箱保持過夜，PBS清洗5 min×3，加二抗（生物素標記的抗兔IgG）于37℃恒溫孵育30 min，PBS清洗5 min×3，加DAB顯色液顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。每張切片隨機選取5個視野進行圖像采集，并利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析測定其光密度值（OD）進行比較。

2.5統計學方法所有計量資料均采用SPSS17.0統計學軟件進行統計，運用Kolmogorov–Smirnov test分析均屬于正態分布。采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）比較，組間兩兩比較采用Dunnetts t-test。P<0.05視為差異有統計學意義。

3結果

3.1各組大鼠一般表現空白組大鼠無異常表現；模型組動物在接受OVA霧化吸入后開始表現為豎毛、煩躁、抓耳撓鼻、呼吸急促，后表現為精神倦怠、蜷縮、腹肌抽搐、甚至有大小便失禁等；布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組上述表現程度均較模型組減輕。

3.2各組大鼠肺組織病理形態學改變光鏡下觀察肺組織HE染色病理片。空白組大鼠各級支氣管無明顯炎癥細胞浸潤，結構正常。模型組大鼠支氣管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，皺襞增多，部分肺泡腔增大、破裂、融合。布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織病理形態改變均較模型組減輕。見圖1。

3.3各組大鼠肺組織IL-17免疫組化比較模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值均較空白組顯著增高（P=0.000，0.000，0.000均<0.01）；布地奈德組和清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值較模型組顯著降低（P=0.000<0.01）；布地奈德組與清肺利氣通絡顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值比較差異無統計學意義（P=0.547>0.05）。見圖2、表1。

4討論

我國兒童哮喘已呈逐年上升趨勢，對患兒身心健康以及家庭社會產生嚴重影響[3，4，10]。而哮喘的發病機制極為復雜，尚不完全明確，目前公認與免疫、神經內分泌因素和遺傳學背景等密切相關。最新的研究表明，除了Th1/Th2失衡在哮喘的發病中起到重要作用，Th17細胞分泌的IL-17在哮喘的發病過程中同樣起到了關鍵作用[11-12]。IL-17能夠通過某些炎癥因子或趨化因子介導而募集活化的炎癥細胞于氣道內聚集，進而導致哮喘相關的病理因素增加，進而誘發或加重哮喘[8，11]。實驗研究表明模型組大鼠肺組織IL-17表達顯著高于空白組，與文獻報道結果一致。

根據全球哮喘防治創議（GINA）及我國兒童支氣管哮喘診斷與防治指南，哮喘的治療主要依賴于吸入糖皮質激素（ICS），如布地奈德、氟替卡松等，并根據階梯方案適當選擇白三烯受體拮抗劑或/和β2受體激動劑，嚴重者需要使用全身激素等[3]。有報道哮喘兒童ICS治療易引起口腔菌群失調，治療的前1～2年可能減緩生長速度，且家長對于長期吸入激素的心理壓力，往往造成治療依從性下降，導致哮喘反復發作[3，13]。

中醫學認為哮喘的發作，是由于內有伏痰，感受外邪而誘發。所謂外邪侵入肺經，肺失宣肅，肺氣閉阻，引動伏痰，痰凝氣道，氣機升降不利，而致喘息、呼吸困難、喉間痰鳴，發為哮喘[14]。筆者認為肺絡是由肺經分出后，又逐層分級，形成由別絡至孫絡的布散于肺組織的各級分支組成的一個系統的網絡系統。肺絡在解剖形態上與類似于現代醫學的氣管支氣管，在功能上包括了現代醫學意義上的氣管支氣管以及神經、內分泌及免疫系統的功能[15]。因此，哮喘發作實質是外邪引動伏痰，肺絡閉阻，氣機不利而致喘息、痰鳴等證候。在哮喘治療上，運用清肺利氣通絡法組方的清肺利氣通絡顆粒治療兒童哮喘取得了滿意的臨床療效。其組成主要為炙麻黃、杏仁、生石膏、生甘草、浙貝母、地龍、紫蘇子和葶藶子。方中麻黃辛溫，開肺平喘，解表散邪，有宣肺利氣通絡之功；杏仁利氣平喘，并與麻黃相使，助麻黃平喘；生石膏味甘、辛，性寒，與麻黃、杏仁合用，寓麻杏甘石湯之意而宣肺泄熱，清肺利氣平喘。此外，方中葶藶子歸肺、膀胱經，有瀉肺滌痰、利氣平喘之功；紫蘇子利氣定喘，止嗽消痰；地龍味咸性寒，長于清熱平肝、熄風止痙、平喘、利尿、通絡除痹，本方之中取其清肺熱、通肺絡、平氣喘之用，更可增麻黃宣通肺絡之功；浙貝母苦寒，歸肺、心經，具有清熱化痰、利氣止咳、消痰散結之功，全方合用具有較好的清肺利氣、通絡平喘的功效。

本研究表明，清肺利氣通絡顆?？梢酝ㄟ^減輕哮喘大鼠肺組織IL-17的表達，改善肺組織病理形態，與布地奈德干預組比較，無明顯的差異，具有較好的效果，提示清肺利氣通絡法中藥治療支氣管哮喘具有很好的優勢，值得進一步深入研究。

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