無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查與結果分析

張媛媛，劉曉亮，初國銘，崔婉婷，何蓉，趙彥艷

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004)

·論著·

無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查與結果分析

張媛媛，劉曉亮，初國銘，崔婉婷，何蓉，趙彥艷

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004)

目的 探討無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查的應用價值。方法 收集5 469例孕婦外周血標本，提取血漿游離DNA進行高通量測序篩查胎兒染色體非整倍體，對21、18、13和性染色體三體高風險者行羊水或臍血穿刺，進行多重定量熒光PCR(QF-PCR)檢測和染色體核型分析驗證。結果 無創篩查出染色體非整倍體高風險樣本71例(1.3%)，其中21-三體30例(1例為嵌合型)、18-三體7例、13-三體6例、X染色體數量增多11例、X染色體數量減少17例。21、18、13-三體除有5例未做介入性產前診斷，3例為假陽性外，其余均與QF-PCR和核型分析驗證結果一致。性染色體陽性結果者經核型分析驗證有13例為異常，準確率為46.4%。其余5 398例無創篩查陰性結果者后期經B超監測和電話隨訪，未發現21、18、13以及性染色體非整倍體患兒。結論 無創性胎兒染色體非整倍體篩查技術對21、18、13-三體的檢測準確性較高，可以作為傳統產前篩查診斷策略的有益補充，但對性染色體非整倍體檢測的準確性較低，尚需進一步優化檢測和分析方法。

染色體非整倍體；產前篩查；DNA高通量測序技術；血漿游離DNA

染色體非整倍體是出生缺陷最常見的遺傳性病因，常見類型有21-三體、18-三體、13-三體、X-三體、Klinefelter綜合征、Turner綜合征等[1]。患兒常表現為先天性非進行性智力障礙，生長發育遲緩和(或)合并畸形，目前尚無有效的治療方法。傳統的產前篩查和診斷方法(孕早期超聲檢查、孕中期血清學篩查、羊水細胞染色體核型分析)均有一定的局限性。隨著新一代測序技術研究的深入，無創性胎兒基因檢測得到了快速發展，其通過對孕婦外周血血漿游離DNA檢測，經生物信息學分析，可無創篩查胎兒常見染色體非整倍體，已成為國內外產前篩查的熱點項目。本研究采用多重定量熒光(QF)-PCR檢測和核型分析驗證，評估無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查在產前篩查診斷中的價值，為該技術在臨床合理應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～12月于中國醫科大學附屬盛京醫院產科和遺傳科就診，并自愿接受無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查的孕婦5 469例。孕婦均為單胎妊娠，孕周為12～34+6周。采用Cell-Free DNA BCT管(Streck，美國)采集靜脈血8～10 mL用于檢測。

1.2 無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查方法 將采血管于4 ℃下1 600 g離心10 min，吸取上清分裝到1.5 mL離心管中。離心管室溫16 000 g離心10 min，吸取中間層血漿約4 mL，轉入3支1.5 mL血漿收集管中，取一支血漿進行檢測，其余置于-80 ℃超低溫冰箱保存。利用血漿游離DNA提取試劑盒(磁珠法，貝瑞和康)提取血漿游離DNA，Qubit Fluorometer核酸定量計檢測DNA濃度。合格的DNA樣本經文庫制備、文庫混合后，通過Illumina NextSeq CN500基因測序儀完成高通量測序。進入貝比安數據分析系統3.0(貝瑞和康)錄入樣本信息和芯片，查看質控，分析數據，判斷胎兒是否為染色體非整倍體患兒。對于篩查結果為高風險孕婦，簽署知情同意書后，采集羊水或臍血，進行QF-PCR檢測和細胞的染色體核型分析。

1.3 羊水和臍血采集 在超聲指導下行羊膜腔穿刺術采集羊水25 mL或臍靜脈穿刺術采集臍血2 mL。

1.4 QF-PCR檢測 按照文獻[2]的方法，采用Chelex-100法提取基因組DNA。取羊水1.5 mL，12 000 r/min離心2 min，吸棄上清；取臍血20 μL，加1 mL純水，劇烈渦旋10 s，12 000 r/min離心2 min，吸棄上清；在收集的羊水和臍血細胞中加5%Chelex-100溶液100 μL，劇烈渦旋10 s，56 ℃水浴30 min；劇烈渦旋10 s，100 ℃煮沸8 min，再劇烈渦旋10 s，12 000 r/min離心4 min，取上清用于PCR。針對21、18、13、X和Y染色體上的22個多態性短串聯重復(STR)序列進行多重QF-PCR擴增，產物經PCR純化試劑盒(AxyGene，美國)純化、95 ℃變性、迅速冷卻，于基因分析儀(ABI genetic analyzer 3730，美國)進行毛細管電泳，利用GeneMapper v4.1軟件(Applied Biosystem，美國)讀取片段分析數據，結合英國臨床分子遺傳協會(CMGS)頒布的指南“QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines(2012)v3.01”分析結果。

1.5 染色體核型分析 取羊水20 mL或臍血0.6 mL，按照常規方法進行細胞接種、培養、收獲、制片和G顯帶，利用Leica全自動染色體分析系統進行中期細胞的掃描和圖像采集，分析5個核型，計數15個中期分裂相，遇到嵌合型時增加計數至30個或以上，參照人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN(2009)進行核型分析診斷。

2 結果

5 469例孕婦無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查結果提示高風險者71例，占樣本總數的1.3%，包括21-三體30例(1例為嵌合型)、18-三體7例、13-三體6例、X染色體數量增多11例和X染色體數量減少17例。其中66例接受了羊水或臍血的多重QF-PCR檢測和核型分析，其余5例高風險者(包括3例21-三體和2例18-三體)由于B超提示多發畸形，未進一步行介入性產前診斷而選擇直接引產。多重QF-PCR結果和核型分析結果均顯示48例與無創篩查結果一致，包括25例21-三體、5例18-三體、5例13-三體、6例47,XXN和7例(2例嵌合型)45,X，除有1例懷疑47,XXX胎兒孕婦由于本人也是47,XXX而選擇繼續妊娠，其余孕婦均選擇終止妊娠；另2例21-三體、1例13-三體和15例性染色體數量異常高風險者QF-PCR和核型結果正常，孕婦繼續妊娠，出生后經外周血染色體核型分析驗證，結果均正常。見表1。5 398例無創篩查陰性結果孕婦后期經B超監測和電話隨訪，目前尚未發現21、18、13以及性染色體非整倍體患兒。

3 討論

1997年Lo等[3]采用PCR法在孕婦外周血中檢測到Y染色體特異性片段，證實母體外周血血漿、血清中存在胎兒游離DNA。自此，科研人員開始研究利用胎兒游離DNA進行產前胎兒基因檢測。2008年，Chiu等[4]和Fan等[5]兩個研究組分別對孕婦外周血中游離DNA進行高通量測序，通過計算21號染色體片段與其他所有染色體片段的比例，準確篩查出21-三體胎兒。隨著新一代測序技術的快速發展，無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查以其靈敏、準確、快速、無流產風險的優勢得到了醫生和孕婦的青睞，已在美國、澳大利亞等發達國家推廣應用[6、7]，國內多個產前診斷中心也已廣泛開展。

表1 71例無創性胎兒常見染色體非整倍體篩查高風險者多重QF-PCR檢測和核型分析結果

本研究中我們成功提取5 469例孕婦的外周血血漿游離DNA并進行胎兒常見染色體非整倍體篩查，檢出21、18、13-三體高風險者43例，除去5例未行介入性產前診斷，其余38例高風險者有3例是假陽性，包括2例21-三體和1例13-三體，無創篩查21、18、13-三體的總體符合率達到99.9%，敏感性為100%，特異性為99.9%。回顧國內其他研究組報道的結果，Zhou等[8]檢測了7 705例份樣本，發現無創DNA檢測對21、18、13-三體檢測的靈敏度和特異度分別為100%和99%；林穎等[9]檢測了7 050例份樣本，報道的敏感性和特異性分別為100%和99.96%；劉靜等[10]檢測了4 003例份樣本，證實無創DNA檢測對18、21-三體檢測的符合率達100%。以上研究表明，基于新一代測序技術的無創胎兒染色體非整倍體篩查對21、18、13-三體檢測具有較高的準確性。不容忽視的是本研究以及上述研究組在檢測中均發現了假陽性樣本，由于母體血漿中的游離DNA來源于母體和胎盤組織，因此母體嵌合、胎盤嵌合、胎兒游離DNA比例低/高等因素都可能影響篩查結果的準確性[11]。金玉霞等[12]分析了1例18-三體假陽性胎兒分娩后的胎盤組織，證實為胎盤18-三體嵌和，說明無創篩查出的高風險者尚需進一步行介入性產前診斷確診。另外，無創篩查也能準確提示嵌合型的樣本，本研究中有1例嵌合型21-三體，核型分析結果為47,XN,+21[34]/46,XN[16]，而QF-PCR對嵌合體的診斷有一定局限性，只檢測出嵌合比例高的核型，提示為21-三體。

本研究中我們除篩查到21、18、13-三體外，還有28例樣本為性染色體非整倍體高風險，經核型分析驗證有13例為異常，準確率為46.4%，說明無創篩查胎兒性染色體非整倍體具有一定價值，但由于母體性染色體異常、胎盤嵌合等原因使無創篩查對于胎兒性染色體異常檢測的準確率較低，假陽性率較高[13、14]。

產前篩查的主要目的之一是減少不必要的介入性產前診斷，無創胎兒常見染色體非整倍篩查與傳統的血清學篩查相比，有較高的敏感性和特異性，對21、18、13-三體均具有較好的陽性和陰性預測價值，特別是一定程度上提高了性染色體異常的檢出率。一些血清學篩查陽性結果的孕婦可能會選擇進一步行無創篩查而非介入性產前診斷，但是研究表明，與核型分析相比，無創篩查會漏診約20%的其他染色體異常病例[15、16]，包括目標染色體以外的其他染色體非整倍體和假陰性樣本；即如果血清學篩查高風險而無創篩查結果正常，則染色體異常風險約為2%[15]。另外，無創篩查也無法檢測B超提示異常胎兒的染色體微小缺失、重復或其他畸變，對雙胎、多胎妊娠也存在一定的檢測局限性。

綜上所述，無創篩查只能作為一種較精確的篩查，而不能取代現行的任何其他檢測項目，只有將其與遺傳咨詢和現有的產前篩查診斷模式很好地結合起來，才能充分發揮各自技術優勢，為臨床提供準確參考。

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Non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening and result analysis

ZHANGYuanyuan,LIUXiaoliang,CHUGuoming,CUIWanting,HERong,ZHAOYanyan

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

ObjectiveTo explore the application value of non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening.MethodsA total of 5 469 maternal peripheral blood samples were collected, and plasma free DNA was extracted for high throughput sequencing to detect fetal chromosomal aneuploidies. Samples with high risk of trisomies 21, 18, 13, X and Y were verified by multiplex quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) and karyotype analysis by using amniotic fluid or cord blood.ResultsAfter non-invasive prenatal screening, 71 (1.3%) showed positive results, including 30 cases of trisomy 21, 7 cases of trisomy 18, 6 cases of trisomy 13, 11 cases with increased X chromosome, and 17 cases with decreased X chromosome. In trisomies 21, 18 and 13, 5 cases rejected interventional prenatal diagnosis, 3 cases were false positive, and the rest were all consistent with the results of QF-PCR and karyotyping. In positive results of sex chromosome aneuploidies, 13 cases were confirmed abnormal by karyotyping, and the accuracy rate was about 46.4%. The other 5 398 pregnant women with negative screening results were monitored by B ultrasound and were telephoned for follow-up, and none of them were found trisomies 21, 18, 13, X and Y.ConclusionsNon-invasive fetal chromosomal aneuploidy screening can accurately detect trisomies 21, 18 and 13, which can serve as a useful complement to traditional prenatal screening and diagnosis. While the accuracy of sex chromosome aneuploidies detection is low, we still need to further optimize the detection and analysis method.

chromosomal aneuploidy; prenatal screening; DNA next-generation sequencing technology; plasma free DNA

國家自然科學基金資助項目(81500242，31571198)。

張媛媛(1983-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向為常見單基因病和染色體病的遺傳學診斷。E-mail： zyy.0526@163.com

趙彥艷(1960-)，女，博士，教授，主要研究方向為心血管疾病的分子遺傳學。E-mail： yyzhao@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.001

R596.1

A

1002-266X(2017)20-0001-04

2016-04-08)