膀胱癌相關lncRNA及其共表達mRNA的初步篩選與功能預測

舒靜，黃夢鴿，田強，姜源，陳俊霞

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000；2重慶醫科大學)

膀胱癌相關lncRNA及其共表達mRNA的初步篩選與功能預測

舒靜1，黃夢鴿1，田強1，姜源1，陳俊霞2

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000；2重慶醫科大學)

目的 篩選出在膀胱癌組織中特異性表達的長鏈非編碼RNA(lncRNA)及其共表達mRNA，并進行初步驗證及功能預測。方法 采用lncRNA v4.0芯片篩選4對膀胱癌和癌旁組織中lncRNA及其共表達mRNA的差異表達譜，通過聚類分析比較二者表達差異；采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法對5個異常調節的lncRNA(RP11-359E19.2、AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3、AK021804)和4個共表達的mRNA(HRAS、VEGFA、ITGB1、DNMT3B)進行驗證。同時，對lncRNA共表達的mRNA進行GO及KEGG pathway富集分析。結果 差異表達的lncRNA共4 155條，其中2 045條高表達、2 110條低表達；與lncRNA共表達的mRNA共4 416條，其中2 472條高表達、1 944條低表達。|FC|≥10的lncRNA 345條，包括127條高表達和218條低表達。RP11-436F21.1和H19是上調最明顯的lncRNA。|FC|≥10的共表達mRNA有75條，其中57條上調、18條下調。與癌旁組織相比，膀胱癌組織5種lncRNA中RP11-359E19.2表達上調，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表達下調(P均<0.05)；4種共表達的mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表達均上調(P均<0.05)；qRT-PCR結果與芯片結果一致。GO分析顯示，上調的共表達mRNA主要參與細胞代謝和有絲分裂的生物學過程，下調的共表達mRNAs主要參與免疫系統的刺激反應和免疫應答；KEGG pathway富集分析顯示，10個通路與上調或下調的共表達mRNA有關，其中在上調的共表達mRNA中，p53信號通路和膀胱癌的富集度最高，在下調的共表達mRNA中細胞因子-因子受體相互作用富集度最高。結論 成功篩選出膀胱癌特異表達的lncRNA及其共表達mRNA，這些特異表達的lncRNA及共表達mRNA在膀胱癌的發生、發展和轉移中發揮重要的生物學作用，有望成為膀胱癌新的標志物。

膀胱癌；長鏈非編碼RNA；lncRNA芯片；信息學分析

近年來膀胱癌發病率有逐年升高之勢。膀胱癌術后易復發和轉移，患者預后極差[1]。迄今腫瘤發生、發展及轉移的根本原因和機制還不完全清楚，部分關鍵腫瘤標志物尚未被發現。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組長度>200 nt且不具有編碼蛋白功能的RNA轉錄本，可在表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平調控基因的表達，廣泛參與機體的生理和病理過程[2]。越來越多的研究顯示，lncRNA表達與腫瘤的發生、發展密切相關[3～7]。但目前關于膀胱癌患者血漿中特異性lncRNA新的標志物的篩選與鑒定少見報道。本研究篩選并驗證了膀胱癌組織中特異性lncRNA及其共表達的mRNA，并初步分析、預測了其功能，旨在為膀胱癌的臨床診斷、治療、判斷預后及分子機制研究提供幫助。

1 實驗材料

本研究所用的樣本來自重慶醫科大學附屬第一醫院，收集未經化療和放療的膀胱癌和癌旁組織30例份，樣本均經病理證實，并在手術切除后立即液氮保存。本實驗所有樣本的采集、處理通過重慶醫科大學倫理委員會批準，并征得患者和(或)家屬知情同意。

2 方法與結果

2.1 lncRNA及其共表達mRNA表達譜建立及其特異表達的篩選 抽提4對膀胱癌與癌旁組織總RNA，對抽提所得RNA進行質檢，合格的RNA按照Quick Amp Labeling kit (Agilent Technologies, palo Alto, USA)標記方法對RNA進行擴增、轉錄生成熒光標記的cRNA；標記后樣品雜交于Arraystar公司的Human LncRNA Array v4.0芯片上，漂洗后由Agilent Scanner G2505C掃描儀進行掃描；原始數據采集由Agilent Feature Extraction Software (version 11.0.1.1)軟件完成。應用R Software Package進行原始數據標準化與進一步的數據分析。將膀胱癌組織與癌旁組織相比較，篩選出特異表達的lncRNA及其共表達mRNA(|FC| ≥ 2.0，且P< 0.05，FRD<0.05)。結果顯示，與癌旁組織相比，膀胱癌組織差異表達的lncRNAs共4 155條，其中2 045條高表達、2 110條低表達；lncRNA共表達mRNA共4 416條，其中2 472條高表達、1 944條低表達。差異表達的lncRNA中|FC|≥10者345條，包括127條高表達和218條低表達。RP11-436F21.1 (FC: ～236)和H19(FC: ～30)是上調最明顯的lncRNA。|FC|≥10的共表達mRNA有75條，其中57條上調、18條下調。膀胱癌與癌旁組織lncRNA及其共表達mRNAs層次聚類圖見插頁Ⅱ圖1。

2.2 特異表達的LncRNA及其共表達mRNA的驗證 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法進一步驗證表達差異的lncRNA和共表達mRNA的表達水平，我們從芯片結果中篩選出特異表達的5個lncRNA(RP11-359E19.2、AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3、AK021804)和4個共表達的mRNA(HRAS、VEGFA、ITGB1、DNMT3B)。按照TRIzol試劑盒說明書分別提取膀胱癌和癌旁組織中細胞總RNA，經逆轉錄反應和PCR反應檢測mRNA表達水平。RP11-359E19.2上游引物： 5′TTTCCCTTCTCA-ACGACCTG3′；下游引物：5′GAGTAAAGACAAGCTGAACCCA3′；AL928768.3上游引物：5′AGATGCCGCCTCCCTATGT3′；下游引物：5′CACGGTCAGTGCTGTGCTAT3′；AC002519.6上游引物：5′TGCTCATTTCACTCCACCCA3′；下游引物：5′ATTTCCTTTGCCTTCTCGC3′；RP11-79H23.3上游引物：5′GCAA-GGAGAGTAATGCTGGA3′；下游引物：5′CAATGAGGATGAGAAGAGGTC3′；HRAS上游引物：5′CAGTACAGGGAGCAGATCAAACG3′ ；下游引物：5′TGAGCCTGCCGAGATTCCA3′；VEGFA上游引物：5′CATGCAGATTATGCGGATCAA3′ ；下游引物：5′GCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG3′；ITGB1上游引物：5′GA-ATGCCTACTTCTGCACGATGT3′；下游引物：5′TGTTCCTTTGCTACGGTTGGTTA3′；DNMT3B上游引物：5′AAGAGTTGGGCATAAAGGTAGGA3′；下游引物：5′GGCTGGATTCACATTTGAGAGA3′；β-actin上游引物：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′；下游引物：5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′。采用SYBR? Pre-mix Ex TaqⅡ試劑盒，應用實時定量PCR擴增儀(ABI 7500)檢測每個擴增循環后SYBR? Green熒光信號水平。反應體系共10 μL：上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 2 μL，2×Master Mix 5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。收集熒光信號，建立熔解曲線，運用熔解曲線檢測擴增產物純度。采用相對定量2-ΔΔCt法對獲得的CT值進行分析。

結果顯示，與癌旁組織相比，膀胱癌組織5種lncRNAs中RP11-359E19.2表達上調，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表達均下調(P均<0.05)，見表1；4種共表達mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表達均上調(P均<0.05)，見表2。qRT-PCR結果與芯片結果一致。

表1 膀胱癌組織與癌旁組織5種lncRNA表達

注：與癌旁組織比較，*P<0.05。

表2 膀胱癌組織與癌旁組織4種與lncRNA共表達的mRNA表達

注：與癌旁組織比較，*P<0.05。

2.3 lncRNA共表達mRNA的功能預測 采用GO和KEGG pathway富集分析對lncRNA共表達的mRNA進行功能預測，推斷lncRNA的功能。GO分析(http://www.geneontology.org)通過生物過程、細胞組分和分子功能三部分對基因或蛋白質進行相應的注釋以及分類。對共表達mRNA進行KEGG pathway分析，通過富集分數顯示相關信號通路的重要性。GO分析結果顯示，上調的共表達mRNA主要參與細胞代謝和有絲分裂等生物學過程；下調的共表達mRNAs主要參與免疫系統的刺激反應和免疫應答。KEGG pathway富集分析顯示，10個通路與上調的共表達mRNA有關，10個通路與下調的共表達mRNA有關。在上調的共表達mRNA中，p53信號通路和膀胱癌的富集度最高；在下調的共表達mRNAs中，細胞因子-因子受體相互作用富集度最高。采用Cluster 3.0程序完成hierarchical clustering分析，結果以TreeView 1.60程序可視化，見插頁Ⅱ圖2。

3 討論

lncRNA是在真核生物中新發現的一類長度>200個核苷酸，沒有長閱讀框架，但多具有mRNA結構特征(帽式結構和poly A尾巴)的RNA[8]。近年來研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄、激活、剪切、轉錄干擾、表觀遺傳學調控、免疫監控等多種重要的生物學過程，其轉錄和功能失調可能導致多種疾病的發生[9]。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但絕大部分lncRNA的功能仍不明確，越來越多的研究表明，lncRNA作為癌基因和抑癌基因在腫瘤中異常表達，且lncRNA的突變和異常調節與人類疾病密切相關，lncRNA作為新的生物標志物在輔助診斷、判斷治療效果中發揮重要作用[10]。

本研究膀胱癌組織特異表達lncRNA的篩選結果顯示，|FC|≥10的lncRNA有345條，包括127條高表達的和218條低表達。RP11-436F21.1是上調最明顯的lncRNA，而H19是在膀胱癌組織上調最明顯的lncRNA之一。研究發現，膀胱癌組織H19表達水平不僅與分化程度、病理分期、復發轉移相關[11]，還可通過上調P57的表達，促進膀胱癌腫瘤細胞侵襲與轉移、血管形成[12]。提示lncRNA在膀胱癌中的表達具有特異性，lncRNA的表達量可能成為潛在的膀胱癌診斷和靶向治療生物標志。

為進一步驗證特異表達的lncRNA和共表達mRNA的表達水平，我們從芯片結果中篩選出特異表達的5個lncRNA和4個共表達mRNA。qRT-PCR結果顯示，與癌旁組織相比，膀胱癌組織5種lncRNA中RP11-359E19.2表達上調，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表達下調；4種共表達mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表達均上調。qRT-PCR結果與芯片結果一致。

本研究篩選出特異表達lncRNA及其共表達mRNA的表達譜，通過GO和KEGG pathway富集分析其共表達mRNA的生物學功能，以推斷lncRNA的功能。GO分析結果顯示，與癌旁組織相比，膀胱癌組織中上調的共表達mRNA主要參與細胞代謝和有絲分裂等生物學過程；下調的共表達mRNA主要參與免疫系統的刺激反應和免疫應答等，進一步證實了免疫系統功能下降與腫瘤發生密切相關[13]。KEGG pathway富集分析結果顯示，與癌旁組織相比，10個顯著信號通路分別與上調的共表達mRNA和下調的共表達mRNA有關。其中在上調的共表達mRNA中，p53信號通路和膀胱癌的富集度最高，在下調的共表達mRNAs中，細胞因子-因子受體相互作用富集度最高。這些結果與Zhu等[14]研究結果一致，提示與lncRNAs共表達的mRNAs可能通過調節相關通路在膀胱癌的發生、發展中發揮著至關重要的作用。

綜上所述，本研究發現并篩選出膀胱癌特異表達的lncRNA及其共表達mRNA，這些差異表達的lncRNA及共表達mRNA在膀胱癌的發生、發展和轉移中發揮重要的生物學作用，有望成為膀胱癌新的標志物，為進一步研究膀胱癌的發生機制奠定基礎。

[1] Zhao F, Lin T, He W, et al. Knockdown of a novel lincRNA AATBC suppresses proliferation and induces apoptosis in bladder cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(2):1064-1078.

[2] Chen Z, Luo Y, Yang W, et al. Comparison analysis of dysregulated lncRNA profile in mouse plasma and liver after hepatic ischemia/reperfusion injury[J]. PLoS One, 2015,10(7):e0133462.

[3] Huarte M, Rinn JL. Large non-coding RNAs: missing links in cancer[J]. Hum Mol Genet, 2010,19(R2):R152-161.

[4] Xie H, Ma H, Zhou D. Plasma HULC as a promising novel biomarker for the detection of hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:136106.

[5] Hessels D, Klein Gunnewiek JM, van Oort I, et al. DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer[J]. Eur Urol, 2003,44(1):8-15; discussion 15-16.

[6] Huang KC, Rao PH, Lau CC, et al. Relationship of XIST expression and responses of ovarian cancer to chemotherapy[J]. Mol Cancer Ther, 2002,1(10):769-776.

[7] Yang F, Zhang L, Huo XS, et al. Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[J]. Hepatology, 2011,54(5):1679-1689.

[8] Hung T, Chang HY. Long noncoding RNA in genome regulation: prospects and mechanisms[J]. RNA Biol, 2010,7(5):582-585.

[9] Orom UA, Derrien T, Beringer M,et al. Long noncoding RNAs with enhancer-like function in human cells[J]. Cell, 2010,143(1):46-58.

[10] Esteller M. Non-coding RNAs in human disease[J]. Nat Rev Genet, 2011,12(12):861-874.

[11] Luo M, Li Z, Wang W,et al. Long non-coding RNA H19 increases bladder cancer metastasis by associating with EZH2 and inhibiting E-cadherin expression[J]. Cancer Lett, 2013,333(2):213-221.

[12] Bozdogan O, Atasoy P, Batislam E,et al. Significance of p57(Kip2) down-regulation in oncogenesis of bladder carcinoma: an immunohistochemical study[J]. Tumori, 2008,94(4):556-562.

[13] Bigley AB, Spielmann G, LaVoy EC, et al. Can exercise-related improvements in immunity influence cancer prevention and prognosis in the elderly[J]. Maturitas, 2013,76(1):51-56.

[14] Zhu YP, Bian XJ, Ye DW,et al. Long noncoding RNA expression signatures of bladder cancer revealed by microarray [J]. Oncol Lett, 2014,7(4):1197-1202.

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關于醫學名詞與統計學符號的應用說明

醫學名詞要以1989年及以后由全國自然科學名詞審定委員會審定、公布，科學出版社出版的《醫學名詞》和相關科學的名詞為準，暫未公布者仍以人民衛生出版社出版的《英漢醫學詞匯》為準。中文藥物名稱應使用1995年藥典(法定藥物)或衛生部藥典委員會編輯的《藥名詞匯》(非法定藥物)中的名稱，英文藥物名稱則采用國際非專利藥名，不用商品名。

Preliminary screening and functional prediction of long non-coding RNA and its co-expression mRNA in bladder carcinoma

SHUJing1,HUANGMengge,TIANQiang,JIANGYuan,CHENJunxia

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo screen out differentially expressed long non-coding RNAs (lncRNAs) and co-expression mRNAs and to perform the preliminary validation and functional prediction in bladder carcinoma.MethodsFour pairs of carcinoma and para-carcinoma tissues were used for microarray assay to screen out the differentially expressed lncRNAs and co-expression mRNAs. Hierarchical clustering was performed to show lncRNA and mRNA expression patterns among samples. Five lncRNAs (RP11-359E19.2, AL928768.3, AC002519.6, RP11-79H23.3, AK021804) and four co-expression mRNAs (HRAS, VEGFA, ITGB1, DNMT3B) were chosen for verification of the microarray results by quantitative real-time PCR. Gene Ontology (GO) and KEGG pathway were used to analyze the biological function of co-expression mRNA.ResultsA total of 4 155 lncRNAs and 4 416 co-expression mRNAs were detected to be differentially expressed, among which, 2 045 lncRNAs were up-regulated and and 2 110 were down-regulated, meanwhile, 2 472 co-expression mRNAs were up-regulated and and 1944 were down-regulated, respectively. Totally 345 lncRNAs displayed fold change ≥10, including 127 up-regulated lncRNAs and 218 down-regulated lncRNAs. RP11-436F21.1 and H19 were the most up-regulated lncRNAs. Overview of coding gene profile showed that 75 mRNAs had fold change ≥10 (up: 57; down: 18). Comapred with the para-carcinoma tissues, the expression of RP11-359E19.2 in 5 lncRNAs was up-regulated, whereas AL928768.3, AC002519.6, RP11-79H23.3, and AK021804 expression was down-regulated in the bladder carcinoma tissues (allP<0.05). Meanwhile, the expression of HRAS, VEGFA, ITGB1, and DNMT3B in four co-expression mRNAs was all up-regulated (allP<0.05). The result was consistent with the microarray assay. GO assay showed that the up-regulated co-expression mRNAs mainly participate in the biological processes, such as cellular metabolic and mitotic cell cycle. Meanwhile, the down-regulated co-expression mRNAs mainly participate in the immune system process of stimulus response and immune response. KEGG pathway assay showed that 10 pathways were associated with the up-regulated or down-regulated mRNAs. Among the co-expression mRNAs, the enrichment of P53 signal pathway and bladder cancer was the highest, whereas in the down-regulated co-expression mRNAs, the cytokine-factor receptor interaction was the highest.ConclusionsThe differentially expressed LncRNAs and co-expression mRNAs are found and screened out in the bladder cancer. The specially expressed lncRNAs and and mRNAs could play important roles in the pathogenesis and development of bladder carcinoma, which might be new markers of bladder cancer.

bladder carcinoma; long non-coding RNA; LncRNA chip; informatics analysis

國家自然科學基金資助項目(81672536)。

舒靜(1986-)，女，碩士，技師，主要研究方向為腫瘤相關基因的篩選及其功能預測。E-mail： shujing0723@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.002

R737.14

A

1002-266X(2017)20-0005-04

2016-08-31)