神經干細胞和多巴胺神經元聯合移植對帕金森病大鼠運動障礙的影響

李智高，徐蛟天，陳孝祥，林海，宋曉斌，楊智勇，鄧興力

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

神經干細胞和多巴胺神經元聯合移植對帕金森病大鼠運動障礙的影響

李智高，徐蛟天，陳孝祥，林海，宋曉斌，楊智勇，鄧興力

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

目的 探討神經干細胞和多巴胺神經元聯合移植改善帕金森病大鼠運動障礙的效果。方法 采用經典6-羥基多巴胺毀損法構建帕金森病大鼠模型36只，腹腔注射阿樸嗎啡連續誘導4周。APO注射第4周將36只帕金森病大鼠隨機分為對照組、多巴胺組、干細胞組及聯合組，每組9只，分別于右側紋狀體區立體定向注入生理鹽水、多巴胺神經元懸液、神經干細胞懸液、多巴胺神經元與神經干細胞懸液。計算各組移植后2、4、6、8周的旋轉次數；干細胞組及聯合組分別于移植后1、2、4、8周行MRI掃描，觀察移植區影像學變化；移植后8周取各組腦組織行普魯士藍染色，觀察移植細胞定植與遷移情況，免疫熒光法檢測移植細胞分化情況。結果 移植后2、4、6、8 周，對照組、神經干細胞組、多巴胺組、聯合組旋轉次數依次降低，組間兩兩比較P均<0.01。MRI檢查結果：隨著時間延長，聯合組與干細胞組移植區T2 W/FFE成像上呈低信號影的區域逐漸變大，但聯合組低信號影范圍大于干細胞組。普魯士藍染色結果：干細胞組和聯合組移植的神經干細胞及其分化后的細胞胞質內均可見大量藍色顆粒，大部分存留在移植針孔附近，僅少部分細胞向遠處遷移，但聯合組藍色顆粒數量以及擴散范圍均大于干細胞組。聯合組巢蛋白(Nestin)、酪氨酸羥化酶(TH)、綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞數及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干細胞組，酸性纖維蛋白(GFAP)陽性細胞數及GFAP/GFP均低于干細胞組(P均<0.01)。結論 神經干細胞與多巴胺神經元聯合移植可顯著改善帕金森病大鼠的運動障礙，更有助于神經干細胞的定植、遷移及分化成為多巴胺神經元。

帕金森病；神經干細胞；多巴胺神經元；神經干細胞移植；神經元移植

帕金森病是一種與多巴胺神經元變性缺失相關的神經退行性疾病，最終引起一系列運動障礙癥狀，目前尚無根治的方法[1]。隨著對帕金森病研究的深入，以替代和補充變性缺失的多巴胺神經元來實現神經元修復和功能重塑，在帕金森病治療中具有巨大的潛在應用價值[2]。綠色熒光蛋白(GFP)基因標記技術是一種新型的細胞示蹤技術，用其標記神經干細胞可穩定表達GFP，具有敏感性強、存在時間久、不影響細胞功能等特點[3]。超順磁氧化鐵(SPIO)是一種新型MRI對比劑，用其標記的神經干細胞可在移植后不同時間點采用MRI動態觀察移植細胞的存活、分化以及遷移情況[4]。 2015年9月～2016年9月，本研究觀察了GFP、SPIO雙標神經干細胞聯合多巴胺神經元移植對帕金森病大鼠運動障礙的改善作用及移植后神經干細胞的遷移及分化情況，旨在為細胞替代療法治療帕金森病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只，SPF級，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。主要試劑及儀器：堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、Alex-Fluor 594羊抗兔IgG及酸性纖維蛋白(GFAP)、酪氨酸羥化酶(TH)、β-3-tubulin多克隆抗體均購自美國Proteintech公司，FBS、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自碧云天生物技術研究所；大鼠腦三維立體定向儀(美國Stoelting公司)。

1.2 神經干細胞和多巴胺神經元建立

1.2.1 大鼠胚胎中腦神經干細胞分離及鑒定 取孕12.5天的SD大鼠1只，無菌條件下取出胚胎中腦組織并剪碎，吹打后200目篩網過濾，1 000 r/min離心5 min，取細胞懸液并調整細胞密度為1×105個/mL，接種于培養瓶。37 ℃、5% CO2條件下采用神經干細胞培養液進行培養， 神經干細胞培養液：含1% N2的DMEM/F12培養基、bFGF(20 μg/L)、EGF(20 μg/L)、1%雙抗。高倍鏡(×200)下觀察細胞生長情況，結果顯示細胞形成神經球，懸浮生長，球中心較暗，周邊折光率較強，未見突起。根據細胞代謝情況每2～3天半量加液，取培養5天的細胞，采用免疫細胞化學法檢測神經干細胞標志物巢蛋白(Nestin)的表達情況，結果顯示Nestin表達呈陽性。將細胞經血清誘導分化培養3天，神經球貼壁并呈分化生長，采用免疫細胞化學法檢測神經元特異性標志物β-3-tubulin、神經膠質細胞特異性標志物GFAP和多巴胺神經元特異性標志物TH的表達，二抗分別為Alex-Fluor594、Alex-Fluor594、FITC羊抗兔IgG，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結果顯示分化后存在以下細胞：呈多角形、有單個或多個突起、GFAP陽性的星形膠質樣細胞；細胞體較大、有軸突和數個短小突起、β-3-tubulin陽性的神經元；細胞體呈梭形或椎體形、發出單個或多個突起、TH陽性的神經元。以上均證實分離出的細胞為神經干細胞。

1.2.2 SPIO、GFP雙標神經干細胞建立 參考前期研究方法[5]，建立SPIO、GFP雙標神經干細胞。

1.2.3 多巴胺神經元分離及標記 參考前期研究方法[6]，分離培養并鑒定多巴胺神經元，以CM-DiI進行標記。結果證實多巴胺神經元純度>90%并用于以下試驗。

1.3 帕金森病模型建立 取36只SD大鼠，以經典6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損法為基礎[7]，改進毀損位點建立帕金森病模型。方法如下：將大鼠以7%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，以前囟為基準點，分別于右側內側前腦束(A/P：-3.6 mm；L：+2.0 mm；V：-8.5 mm)及紋狀體(A/P：+0.4.0 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)注射15 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，術后1周腹腔注射阿樸嗎啡(APO)0.40 mg/kg誘發大鼠做偏側旋轉運動，每周1次，連續誘導4周，觀察大鼠行為學改變。結果顯示部分大鼠術后1周開始出現運動遲滯、四肢震顫等運動障礙；術后2周開始出現向健側異常旋轉運動。隨著時間推移，旋轉動物數量、旋轉圈數均逐漸遞增，術后4周，趨于穩定。每只大鼠術后第4周注射APO 5 min后，計數10 min內的旋轉情況及旋轉次數，以平均向健側(左側)旋轉速度>7 r/min定義為模型建立成功。結果顯示，36只大鼠恒定向健側旋轉運動，且旋轉速度>7 r/min，證實建模成功并用于后續實驗。

1.4 神經干細胞和多巴胺神經元聯合移植對SD大鼠運動障礙改善作用的觀察

1.4.1 分組處理 采用隨機數字表法將36只帕金森病模型大鼠隨機分為對照組、多巴胺組、神經干細胞組(干細胞組)、聯合組，每組9只。多巴胺組、干細胞組分別將5 μL 多巴胺神經元及SPIO、GFP雙標神經干細胞細胞懸液(均含5×105個細胞)立體定向注入右側紋狀體區(A/P：+0.5 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)。聯合組將多巴胺神經元與SPIO、GFP雙標神經干細胞按1∶2的比例進行配比，參照上述方法注入右側紋狀體區。對照組右側紋狀體區注射等體積生理鹽水。

1.4.2 運動功能改善情況觀察 記錄各組移植前及移植后第2、4、6、8周APO誘導后10 min內的旋轉次數，以移植后旋轉次數/移植前旋轉次數計算移植后2、4、6、8周的旋轉次數相對比，比值越低說明治療效果越好。

1.5 神經干細胞移植后的定植、遷移與分化觀察

1.5.1 神經干細胞移植后的定植與遷移 ①MRI掃描。將干細胞組、聯合組分別于移植后1、2、4、8周進行MRI掃描，采用5英寸表面線圈，先進行三平面定位掃描，再行梯度回波T2加權(T2 W/FFE)成像。設置參數：TR 388 ms，TE 23 ms，翻轉角18°，FOV 120 mm，矩陣205×256，層厚 2.0 mm，掃描時間2 min 8 s。觀察各組移植區SPIO標記神經干細胞定植、遷移情況。②普魯士藍染色。移植8周后干細胞組、聯合組常規采用生理鹽水及4%多聚甲醛進行心臟灌注，處死后開顱，取腦組織，用4%多聚甲醛固定，蔗糖梯度脫水，OTC包埋劑包埋，移植點連續10 μm厚度冰凍切片。腦組織切片行普魯士藍染色。200倍顯微鏡下觀察染色情況，以此反映SPIO標記神經干細胞的定植、遷移情況。

1.5.2 神經干細胞移植后的分化 采用免疫熒光法。取1.5.1中干細胞組、聯合組的腦組織切片，封片后10%山羊血清封閉，加入一抗(Nestin 1∶800、TH 1∶800、GFAP 1∶500)冷藏孵育過夜，次日漂洗后添加IgG熒光二抗(Alex-Fluor594羊抗兔IgG，稀釋倍數為1∶200)，避光孵育，封片劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。200倍視野下，連續對5張組織切片移植點處的Nestin、TH、GFAP及GFP陽性細胞進行計數，取平均值。計算Nestin、TH、GFAP陽性細胞數占GFP陽性細胞數的百分比，分別記為Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP，比值越大說明移植神經干細胞的分化率越高。

2 結果

2.1 各組運動障礙改善情況 見表1。

表1 各組旋轉次數相對比比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與多巴胺組比較，#P<0.01；與干細胞組比較，△P<0.01。

2.2 神經干細胞移植的定植與遷移情況 MRI檢查結果顯示：移植1周后，聯合組與干細胞組T2 W/FFE成像均可見細胞移植區呈類圓形低信號影，大部分細胞聚集在移植點附近；隨著時間延長，兩組移植區T2 W/FFE成像上仍呈低信號影，且區域逐漸變大，但聯合組的低信號影范圍大于干細胞組。普魯士藍染色結果顯示：移植8周，聯合組與干細胞組移植的神經干細胞及其分化后的細胞胞質內均可見大量藍色顆粒，大部分存留在移植針孔附近，僅有少數部分細胞向遠處遷移；但聯合組藍色顆粒數量以及擴散范圍均大于干細胞組。

2.3 神經干細胞的分化情況 見表2、3。

表2 干細胞組與聯合組腦組織陽性細胞計數比較(個

注：與干細胞組比較，*P<0.01。

3 討論

移植胚胎多巴胺神經元可提高局部多巴胺水平，從而顯著改善帕金森病動物模型的癥狀[8]，但是移植后多巴胺神經元的存活數量以及生存時間仍有待提高。神經干細胞存在于幼年及成年哺乳動物的中樞神經系統內神經發生相關區域，特別是腦室下區(SVZ)、齒狀回的粒下層(SGZ)[9]。作為多種細胞的祖細胞，神經干細胞的增殖和分化能力受到多種因素的調節，其中一些神經元對神經干細胞分化的方向也有至關重要的影響[10]。國內研究證實，胚胎中腦多巴胺神經元與誘導神經干細胞分化移植治療帕金森病大鼠均具有顯著療效，但同樣都面臨神經干細胞向多巴胺神經元分化率較低的困境[11]。故本研究在此基礎上聯合原代培養的神經干細胞和多巴胺神經元共移植治療帕金森病，以期待實現更好的治療效果。本研究結果顯示，移植后2、4、6、8 周，干細胞組旋轉次數高于多巴胺組，說明移植神經干細胞治療運動障礙的帕金森病療效不如移植多巴胺；這是由于神經干細胞本身是一種前體細胞，分化成為多巴胺神經元才能發揮作用。本研究中，聯合組移植后2、4、6、8 周旋轉次數相對比均低于其他組，可能是由于神經干細胞可定向分化成為多巴胺神經元，其移植后一方面增加了多巴胺神經元的數量，另一方面可能通過刺激因子作用分化成為不同神經元的同時，分泌多種神經營養因子，從而更有利于多巴胺神經元的存活。

表3 干細胞組與聯合組腦組織Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP比較

注：與干細胞組比較，*P<0.01。

SPIO是一種組織特異性磁共振對比劑，具有超順磁性。SPIO顆粒分布于組織后可擾亂內部磁場，引起質子自旋快速失相位，從而縮短組織的T2和T1值，特別是T2值的縮短更明顯，故可采用T2 FFE觀察SPIO標記神經干細胞移植后的定植和遷移情況[12]。動態MRI掃描能提供近細胞級分辨率的圖像和整體影像，分辨率、敏感度均較高。通過MRI示蹤SPIO標記的神經干細胞，能夠在活體上進行直觀追蹤，從而了解其在大鼠腦內的分布、遷徙、分化情況，有助于臨床上進行移植治療后的在體療效觀察和功能恢復評估。GFP基因標記技術具有高效、穩定的特點，可在活細胞穩定表達且易于檢測。本研究中SPIO、GFP雙標NSC，相對于單標可以更加直觀有效地實現對移植活細胞實時定位的追蹤和觀察。CM-DiI是一種無細胞毒性的熒光染料，不影響細胞的生長，適合標記和示蹤細胞，故本研究采用CM-DiI對多巴胺神經元進行標記；MRI檢查結果顯示，聯合組停留在移植原位的細胞隨著移植時間延長逐漸向移植點周圍擴散，擴散范圍大于干細胞組；普魯士藍染色顯示，聯合組相較干細胞組也有上述趨勢。以上均說明，聯合移植相對于單獨神經干細胞移植細胞存活數量更多，細胞遷移的范圍更廣。本研究聯合組Nestin、TH、GFP陽性細胞數及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干細胞組，GFAP陽性細胞數及GFAP/GFP均低于干細胞組；表明聯合移植神經干細胞向多巴胺神經元的分化率高于單獨神經干細胞移植，更有利于神經干細胞向多巴胺神經元分化，但是其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，神經干細胞與多巴胺神經元聯合移植可顯著改善帕金森病大鼠的運動障礙，更有助于神經干細胞的定植、遷移及分化成為多巴胺神經元。

[1] Dong J, Li S, Mo JL, et al. Nurr1-Based Therapies for Parkinson′s Disease[J]. CNS Neurosci Ther, 2016,22(5):351-359.

[2] Fricker RA, Kuiper JH, Gates MA. Transplanting intact donor tissue enhances dopamine cell survival and the predictability of motor improvements in a rat model of Parkinson′s disease[J]. PLoS One, 2012,7(10):e47169.

[3] Ansari AM, Ahmed AK, Matsangos AE, et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments[J]. Stem Cell Rev, 2016,12(5):553-559.

[4] Qi Y, Feng G, Huang Z, et al. The application of super paramagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells in cell-based therapy[J]. Mol Biol Rep, 2013,40(3):2733-2740.

[5] 鄧興力,王應莉,封忠堂,等.SPIO、EGFP雙標GDNF基因修飾中腦神經干細胞移植治療帕金森病[J].中風與神經疾病雜志,2010，27(2):109-113.

[6] 鄧興力,楊智勇,馮忠堂.胚胎多巴胺神經元移植治療帕金森病的實驗研究.[J].中國微侵襲神經外科雜志,2010，15(8):366-368.

[7] Kupsch A, Schmidt W, Gizatullina Z, et al. 6-Hydroxydopamine impairs mitochondrial function in the rat model of Parkinson′s disease: respirometric, histological, and behavioral analyses[J]. J Neural Transm (Vienna), 2014,121(10):1245-1257.

[8] Shukla S, Chaturvedi RK, Seth K, et al. Enhanced survival and function of neural stem cells-derived dopaminergic neurons under influence of olfactory ensheathing cells in parkinsonian rats[J]. J Neurochem, 2009,109(2):436-451.

[9] Ceccatelli S, Tamm C, Sleeper E, et al. Neural stem cells and cell death[J]. Toxicol Lett, 2004,149(1-3):59-66.

[10] Li T, Yu Y, Cai H. Effects of brain-derived neurotrophic factor-pretreated neuron stem cell transplantation on Alzheimer′s disease model mice[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(11):21947-21955.

[11] Barker RA, Drouin-Ouellet J, Parmar M. Cell-based therapies for Parkinson disease-past insights and future potential[J]. Nat Rev Neurol, 2015,11(9):492-503.

[12] 劉新權,景猛,欒彧,等.不同MR掃描序列對腦內移植SPIO標記神經干細胞大鼠的成像對比研究[J].中國侵襲神經外科,2004,9(12):560-562.

Effect of combined transplantation of neural stem cells and dopaminergic neurons on dyskinesia in rats with Parkinson disease

LIZhigao,XUJiaotian,CHENXiaoxiang,LINHai,SONGXiaobin,YANGZhiyong,DENGXingli

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

ObjectiveTo explore the efficacy of combined transplantation of neural stem cells (NSCs) and dopaminergic (DA) neurons in treatment of dyskinesia in rats with Parkinson disease (PD).MethodsThirty-six rat models with PD were established by using the classical 6-hydrodopamine damage protocol, and followed by 4-week rotation induction via apomorphine (APO) intraperitoneal injection. These 36 PD rats were randomly divided into the following groups after 4 weeks of APO intraperitoneal injection: the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group, and normal saline (NS), CM-DiI labeled DA neurons, GFP-SPIO double labeled NSCs, and CM-Dil labeled DA neurons combined with double labeled NSCs neurons were transplanted into the right striatum of these groups by stereotactic injection, respectively. The rotation frequency of these groups was calculated at week 2, 4, 6, and 8 after the transplantation. Moreover, the NSCs group and DA-NSCs group were scanned by MRI at week 1, 2, 4, and 8. The brain tissues of these groups were collected to observe the migration and homing of the transplanted cells after 8 weeks through prussian blue staining, and the differentiation of NSCs was measured by immunofluorescence.ResultsThe rotation frequencies of the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group were decreased gradually, and significant difference was found between every two groups, allP<0.01. The results of MRI scan between NSCs group and NSCs-DA group were as following: over the time of transplantation, the hypointense signal area in T2 W/FFE imaging of both groups were larger than before, and the area in the NSCs-DA group was larger than that of the NSCs group. The results of prussian blue staining suggested that there were a lot of blue particles in the cytoplasm of NSCs and its differentiated cells, which were grafted from the NSCs group and NSCs-DA group. However, just a few cells migrated from the transplantation needle core to the distant, but the most of these blue particles were located on the transplantation sites. And the number of the blue particles in the NSCs-DA group was higher, and its diffusion range was larger than that of the NSCs group. Moreover, there were much more Nestin, TH and GFP positive cells in the NSCs-DA group than in the NSCs group, while the GFAP positive cells and the rates of GFAP/GFP were less than those of the NSCs group (allP<0.01).ConclusionThe combined transplantation of NSCs and DA neurons can improve the movement disorder of PD rats significantly, which helps to promote the grafted NSCs homing, migration, and differentiation into DA neurons.

Parkinson disease; neural stem cells; dopaminergic neuron; neural stem cell transplantation; neuron transplantation

國家自然科學基金資助項目(81241126,81360197)；云南省教育廳科學研究基金資助項目(2013C227)；云南省科技廳-昆明醫學院聯合專項(2014FB041) 。

李智高(1975-)，男，主治醫師，主要研究方向為干細胞移植治療帕金森。E-mail： 459920510@qq.com

鄧興力(1979-)，男，副教授，主要研究方向為干細胞移植治療帕金森。E-mail： dxlkmmu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.007

R742.5

A

1002-266X(2017)20-0024-04

2016-10-23)