人參多糖對(duì)耐順鉑人鼻咽癌細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

孫冰潔

(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433)

人參多糖對(duì)耐順鉑人鼻咽癌細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

孫冰潔

(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433)

目的 探討人參多糖(GPS)對(duì)耐順鉑人鼻咽癌細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。方法 選擇藥物敏感鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作為親本細(xì)胞，并建立耐順鉑的鼻咽癌耐藥細(xì)胞株系CNE-2(簡(jiǎn)稱耐藥CNE-2)。采用MTT法檢測(cè)親本細(xì)胞及耐藥CNE-2經(jīng)GPS作用前后對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并計(jì)算耐藥指數(shù)(RI)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)GPS對(duì)耐藥CNE-2的增殖抑制率；RT-PCR法檢測(cè)GPS作用前后耐藥CNE-2中β-catenin mRNA表達(dá)；顯微鏡觀察GPS作用前后耐藥CNE-2中β-catenin蛋白表達(dá)。結(jié)果 親本細(xì)胞及耐藥CNE-2對(duì)順鉑的IC50分別為(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐藥CNE-2對(duì)順鉑的RI為26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐藥CNE-2對(duì)順鉑的IC50分別為(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分別為9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐藥CNE-2對(duì)順鉑IC50、RI均較作用前明顯降低(P均<0.05)。GPS對(duì)耐藥CNE-2的增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性(P均<0.05)。0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h，耐藥CNE-2中β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.973±0.114、0.809±0.038、0.706±0.050、0.297±0.010，與耐藥CNE-2比較，0.3 g/L及0.4 g/L GPS作用后β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)。GPS作用前β-catenin蛋白的表達(dá)區(qū)域在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)GPS處理后，β-catenin蛋白表達(dá)區(qū)域逐漸向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。結(jié)論 GPS可逆轉(zhuǎn)CNE-2對(duì)順鉑的耐藥性；其機(jī)制可能為通過β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)耐藥株系凋亡。

鼻咽癌；人參多糖；耐順鉑；多藥耐藥；耐藥逆轉(zhuǎn)

鼻咽癌對(duì)放射治療和化學(xué)治療較為敏感，但近年來(lái)出現(xiàn)了耐藥細(xì)胞株，患者5年存活率僅60%左右[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人參的主要藥用價(jià)值成分人參多糖(GPS)在人體內(nèi)外均具有較為明顯的抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用[2]，但其機(jī)制仍不清楚。2016年2～10月，本研究觀察了GPS對(duì)耐順鉑人鼻咽癌細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制，以期解決鼻咽癌的多藥耐藥問題。

1 材料與方法

1.1 材料 GPS注射液為普德藥業(yè)公司(山西)生產(chǎn)(規(guī)格3 g/L)，順鉑為澳大利亞某公司生產(chǎn)；人鼻咽癌低分化細(xì)胞株系CNE-2為香港大學(xué)腫瘤系所提供，二甲基四氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司生產(chǎn)，CCK8試劑由日本同仁研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo) 將CNE-2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2及適宜濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3]。采用MTT法測(cè)定順鉑對(duì)CNE-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50，0.21 μmol/L)；用含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞1天，換含有半數(shù)抑制濃度的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)8天，直至細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)，繼續(xù)傳代3次[4]，測(cè)定此時(shí)的IC50。再用含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基沖擊培養(yǎng)1天，更換為順鉑IC50逐漸提高的培養(yǎng)基，直至細(xì)胞能夠在含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)并且連續(xù)傳代3次[5]，最后測(cè)定順鉑的IC50為7.5 μmol/L，同時(shí)將其命名為耐順鉑的鼻咽癌耐藥細(xì)胞株系CNE-2(簡(jiǎn)稱耐藥CNE-2)。

1.2.2 GPS干預(yù)及藥物敏感性測(cè)定 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本細(xì)胞及耐藥CNE-2，調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，加入96孔板，設(shè)親本細(xì)胞、耐藥CNE-2及GPS(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)處理孔，每孔體積200 μL，做3個(gè)平行孔板[6]。培養(yǎng)48 h，于每個(gè)孔加入15 μL MTT(10 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，于每孔中加入200 μL DMSO，稍震蕩溶解結(jié)晶。以490 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，并在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度數(shù)值[7]，利用MTT分析軟件來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算IC50以及耐藥指數(shù)(RI)，得出藥物敏感性。RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.3 GPS對(duì)耐藥CNE-2增殖影響的觀察 采用CCK8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期耐藥CNE-2，制成密度為5×104個(gè)/L的細(xì)胞懸液，將100 μL的細(xì)胞懸液接種在96孔板上，1天后加入100 μL不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)的GPS培養(yǎng)液，并設(shè)空白對(duì)照，于作用24、48、72 h時(shí)進(jìn)行CCK8比色試驗(yàn)[8]。每次均在處理結(jié)束前4 h，在每個(gè)孔中加入10 μL的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-AGPS/A空白對(duì)照)×100%[9]，結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.4 GPS對(duì)耐藥CNE-2 β-catenin mRNA表達(dá)影響的觀察 采用RT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h的耐藥CNE-2，TRIzol法提取RNA，檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)。PCR反應(yīng)步驟：反應(yīng)體系10 μL(2.5 μL模板，上下引物均勻后取2.5 μL，5 μL的SYBR熒光酶)，循環(huán)環(huán)境條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。最終數(shù)據(jù)利用ABI Prism 7000 SDS軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，ΔCt=源基因Ct-內(nèi)參照Ct，mRNA的表達(dá)=2-ΔCt[10]。

1.2.5 GPS對(duì)耐藥CNE-2 β-catenin蛋白表達(dá)區(qū)域影響的觀察 采用顯微鏡觀察耐藥CNE-2中β-catenin蛋白表達(dá)區(qū)域。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期耐藥CNE-2，接種于6孔板中，37 ℃下于CO2培養(yǎng)箱過夜，待細(xì)胞株均貼壁后，加入0.4 g/L GPS處理48 h，空白對(duì)照加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。4%多聚甲醛室溫條件下固定20 min，PBS沖洗3次(每次10 min)，5%的BSA封閉透膜1 h，PBS沖洗3次(每次5 min)[11]。β-catenin單克隆抗體溶液的稀釋濃度為1∶400，顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GPS作用前后耐藥CNE-2對(duì)順鉑IC50及RI比較 親本細(xì)胞及耐藥CNE-2對(duì)順鉑的IC50分別為(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐藥CNE-2對(duì)順鉑的RI為26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐藥CNE-2對(duì)順鉑的IC50分別為(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分別為9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐藥CNE-2對(duì)順鉑IC50、RI均較作用前明顯降低(P均<0.05)。

2.2 GPS對(duì)耐藥CNE-2增殖的影響 GPS對(duì)耐藥CNE-2的增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性(P均<0.05)。見表1。

表1 不同濃度和時(shí)間點(diǎn)GPS對(duì)耐藥CNE-2的增殖抑制率

注：與0.1 g/L比較，#P<0.05；與相同濃度作用24 h比較，*P<0.05。

2.3 耐藥CNE-2 β-catenin mRNA表達(dá) 0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h后耐藥CNE-2中β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.973±0.114)、(0.809±0.038)、(0.706±0.050)、(0.297±0.010)，組間比較P<0.05。

2.4 耐藥CNE-2 β-catenin蛋白表達(dá)區(qū)域 GPS作用前β-catenin蛋白的表達(dá)區(qū)域在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)GPS處理后，β-catenin蛋白表達(dá)區(qū)域逐漸向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。

3 討論

腫瘤細(xì)胞耐藥性的發(fā)生是藥物作用誘導(dǎo)的結(jié)果還是“不適者淘汰”的選擇機(jī)制所致，目前尚無(wú)定論，更多學(xué)者傾向于雙向作用機(jī)制，因?yàn)槟退幷T導(dǎo)階段，不論是大劑量沖擊還是小劑量逐漸增加，在特定的時(shí)間段都會(huì)引起培養(yǎng)細(xì)胞的死亡，存活細(xì)胞也會(huì)在形態(tài)上有顯著改變，并失去增殖活性[12]。同時(shí)在耐藥起初階段，反復(fù)出現(xiàn)的過程需要更多的新鮮親代細(xì)胞源源不斷的補(bǔ)充，補(bǔ)充的新鮮親代細(xì)胞和已經(jīng)具備一定耐藥性但無(wú)增殖能力的細(xì)胞之間會(huì)建立一種“信息交流”途徑，使得具有增殖能力且耐藥性細(xì)胞最終被選擇出來(lái)，誘導(dǎo)分化，最終耐藥菌株大量出現(xiàn)。

GPS可明顯增加人體的免疫系統(tǒng)功能，還有抗腫瘤以及輔助治療腫瘤性疾病的功能，可提高因放療而被抑制的免疫系統(tǒng)功能[13]，可在一定程度上減輕放療不良反應(yīng)。GPS能調(diào)節(jié)免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性、抑制腫瘤致病因子的作用和抗基因突變。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)生異常改變時(shí)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，而β-catenin是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路中非常重要的信號(hào)傳遞分子。謝方云等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活以β-catenin分子改變?yōu)楹诵模l(fā)現(xiàn)鼻咽癌有Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，GPS作用后，耐藥CNE-2的IC50及RI均明顯降低，耐藥CNE-2增殖明顯抑制，且呈劑量和時(shí)間依賴性；耐藥CNE-2β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)明顯降低，β-catenin蛋白的表達(dá)區(qū)域向胞膜轉(zhuǎn)移，可見GPS下調(diào)了β-catenin的轉(zhuǎn)錄功能以及蛋白的翻譯表達(dá)過程，可能原因在于TCF4作為一種研究較為透徹的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路常見的下游信號(hào)分子，當(dāng)Wnt分子信號(hào)被激活后，TCF4所對(duì)應(yīng)的氨基端會(huì)與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游信號(hào)傳導(dǎo)分子β-catenin Arn重復(fù)序列結(jié)合形成復(fù)合體，并將其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，但氨基端的HMG分子會(huì)與啟動(dòng)子中的靶基因調(diào)控序列相結(jié)合，繼而可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄的激活作用，本研究中發(fā)現(xiàn)了TCF4信號(hào)分子的表達(dá)轉(zhuǎn)移，所以推測(cè)GPS對(duì)于CNE-2的影響可能是通過TCF4影響β-catenin分子的胞核轉(zhuǎn)移以及靶基因的活性結(jié)合產(chǎn)生。

綜上所述，GPS對(duì)耐順鉑人鼻咽癌耐藥細(xì)胞具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制可能是通過β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)耐藥株系CNE-2的凋亡。本研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)鼻咽癌的進(jìn)一步治療以及改善患者預(yù)后具有一定意義。

[1] 劉文娟,高鵬,王大海.人參多糖與他莫昔芬聯(lián)合對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究[J].癌變·畸變·突變,2013,25(4):280-284.

[2] 吳發(fā)玲,施小妹,錢華,等.人參多糖抗腫瘤作用機(jī)制研究新進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志,2010(5):390-391.

[3] 劉藝,陳地龍,何軒,等.人參多糖對(duì)K562細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(12):1181-1184.

[4] 陳亮,唐蘭蘭,顏王鑫,等.人參多糖對(duì)再灌注損傷兔肝臟能量代謝的改善作用及其機(jī)制[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(5):1111-1114.

[5] 黑秀明,黃志華,高立超,等.人參多糖誘生臍血來(lái)源樹突狀細(xì)胞的免疫機(jī)制研究[J].國(guó)醫(yī)論壇,2009,24(5):35-38.

[6] 譚楊,李景,汪暉,等.人參多糖抗大鼠骨關(guān)節(jié)炎及其機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床,2013,29(3):91-93.

[7] 范家銘,劉澤洪,李靜,等.人參多糖介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的凋亡[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(19):3332-3337.

[8] 宋丹,黃克偉.人參多糖注射液對(duì)急性口腔粘膜放射性損傷的保護(hù)作用[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003,24(12):1342-1343.

[9] 謝方云，曾智帆.放療聯(lián)合人參多糖注射液治療鼻咽癌的臨床觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001,21(5):332-334.

[10] 杜承潤(rùn),應(yīng)紅梅.鼻咽癌中P糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白-1的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,38(6):569-573.

[11] 楊樞械,申聰香,文忠,等.人鼻咽癌CD133+干細(xì)胞對(duì)腫瘤多藥耐藥作用的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(18):1385-1390.

[12] 陶仲?gòu)?qiáng),司勇鋒,鄧卓霞,等.鼻咽癌多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘：耳鼻咽喉科學(xué),2006,21(5):299-301.

[13] 劉磊,唐安洲,梁鋼.鼻咽癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究進(jìn)展[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21(24):1150-1152.

[14] 謝方云,管迅行.鼻咽癌放療并用人參多糖注射液的臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,1998,25(10):472-473.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.009

R739.6

A

1002-266X(2017)20-0031-03

2017-02-09)