17p染色體遺傳學不穩定與乳腺癌發生的關系

趙娜，馮玲，楊宇石，徐澍，方藝

(貴州醫科大學，貴陽 550000)

17p染色體遺傳學不穩定與乳腺癌發生的關系

趙娜，馮玲，楊宇石，徐澍，方藝

(貴州醫科大學，貴陽 550000)

目的 檢測乳腺病變組織標本17p染色體區間6個微衛星位點微衛星不穩定(MSI)和雜合性缺失(LOH)情況，進一步探討乳腺癌發生的分子機制。方法 采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)分析方法檢測106例份乳腺病變標本[其中乳腺導管上皮普通型增生(UDH)31例、非典型增生(ADH)10例、乳腺導管原位癌(DCIS)32例、乳腺浸潤性導管癌(IDC)33例]17p染色體上6個微衛星位點(D17S695、D17S261、D17S786、D17S796、D17S831、D17S654)MSI及LOH發生情況。結果 106例標本中6個微衛星位點均有一定頻率的LOH/MSI發生。D17S261、D17S796位點LOH/MSI發生總頻率分別為32.1%、24.5%(P<0.05)。D17S261位點LOH/MSI發生率UDH低于DCIS，DCIS低于IDC(P均<0.01)；D17S796位點LOH/MSI發生率UDH低于DCIS(P<0.01)。結論 乳腺病變組織標本17p染色體區間6個微衛星位點微衛星均有一定頻率的LOH/MSI發生，17p染色體的遺傳學不穩定是乳腺癌發生的前奏，D17S261、D17S796位點在UDH向IDC演變過程中可能起到關鍵作用。

乳腺癌；乳腺疾病；17p染色體；微衛星不穩定；雜合性缺失

近年來乳腺癌的發病率迅速上升，且呈年輕化趨勢[1]。研究發現，微衛星不穩定(MSI)和雜合性缺失(LOH)是腫瘤發生途徑的早期步驟，且是參與癌變的重要機制[2]。目前已有假設提出，乳腺癌有可能與結腸癌類似，是從增生性病變向浸潤性癌演進的一個連續的組織學進程，其過程中通常伴有遺傳學不穩定[3]。目前國內外文獻報道17p染色體在多種腫瘤(如肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等)LOH及MSI發生頻率較高，但在乳腺增生性病變中LOH及MSI發生情況的相關報道較少。本研究在17p染色體上選擇了6個微衛星位點，檢測了106例份乳腺病變組織的MSI及LOH情況，旨在為乳腺癌的早期診斷提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集貴州醫科大學附屬醫院病理科2009～2014年經病理確診的106例份乳腺組織庫存蠟塊，其中乳腺導管上皮普通型增生(UDH)31例、不典型增生(ADH)10例、乳腺導管原位癌(DCIS)32例、乳腺浸潤性癌(IDC)33例。所有病例為女性，年齡(57±21)歲，無家族史，且均為原發腫瘤。標本均已由病理醫師做回顧性診斷。

1.2 MSI及 LOH檢測

1.2.1 DNA提取 石蠟組織切片取8～10片，二甲苯脫蠟完全后加入無水乙醇洗脫，蛋白酶K消化，石蠟組織DNA試劑盒美國Omega提取DNA，測定濃度(A260/A280在1.8～2.0的樣本作為實驗的模板DNA)；-20 ℃保存。

1.2.2 引物合成 選取17p染色體上6個微衛星位點，引物序列見表1。引物序列均來自GenBank數據庫，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)分析 PCR反應體系總體積為50 μL。其中DNA模版2 μL，Taq mix 25 μL(TaKaRa公司產品，內含1.25 U Taq、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L Mg2+及Buffer)，上、下游引物各1 μL，剩余量用滅菌雙蒸水補齊。反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃最后延伸7 min。反應結束后，取5 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳以觀察擴增效果；再取PCR產物5 μL，加變性上樣緩沖液5 μL混勻，進行94 ℃變性10 min，冰浴驟冷，80 V電壓下進行8%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min， 電泳液為1×TBE。電泳結束后， 取下凝膠， 經10%冰醋酸固固定、0.1% AgNO3溶液染色。顯色至條帶清晰，最后觀察結果并記錄。

表1 6個微衛星位點的引物序列及退火溫度

判定標準：與正常組織比較，若被測組織等位基因出現條帶數目的改變或位置遷移記為MSI；若某一條等位基因條帶消失或相對密度減少50%以上記為LOH。陽性結果均重復2次，以排除假陽性。見圖1。

注：T為病變組織，N為正常組織；A箭頭所指為等位條帶消失；B箭頭所指為等位條帶密度減少50%；C箭頭所指為條帶數目增加(本實驗結果MSI以條帶增加為主)。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。多組間率的比較采用兩樣本構成比的χ2檢驗，若組間差異有統計學意義，進一步比較采用χ2分割法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

106例份乳腺病例標本中，D17S695、D17S654、D17S786、D17S796、D17S831、D17S261位點在UDH、ADH、DCIS、IDC中均有不同程度的LOH/MSI發生，見圖2、表2。D17S261、D17S796位點UDH、ADH、DCIS、IDC的LOH/MSI總發生頻率分別為32.1%、24.5%，二者比較P<0.05；D17S695、D17S786、D17S654、D17S831位點UDH、ADH、DCIS、IDC中LOH/MSI發生頻率分別為19.8%、22.6%、34.0%、14.2%，P>0.05。D17S261位點UDH的LOH/MSI發生頻率低于DCIS，DCIS低于IDC(P均<0.01)；D17S796位點UDH的LOH/MSI發生頻率低于DCIS(P<0.01)。

注：T1、N1為DCIS；T2、N2為IDC；T3、N3，T5、N5為UDH；N4、T4為ADH；其中T2箭頭所指為MSI(+)，其余均為LOH(+)。

3 討論

腫瘤的形成主要是由于正常細胞的生長受控、分化受阻所致[4]。大多數研究認為，腫瘤細胞表型的形成關系到兩條獨立的途徑：一種是以DNA錯配修復基因缺陷為主，以基因組MSI為特征；另一種則以腫瘤抑制基因失活為主，以LOH為特征。兩條途徑分別代表了兩種不同基因組不穩定性的機制[5]。

表2 106份標本所在各位點UDH、ADH、DCIS、IDC的LOH/MSI發生頻率(%)

MSI又稱復制錯誤,首先在遺傳性非息肉性結直腸癌中被發現,隨后在胃癌、子宮內膜癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中得以證實，被認為與腫瘤的發生發展有關[6]。微衛星是一種散布于人全基因組中的簡單串列重復序列，多存在于非編碼區內，通常為1～6個堿基對的15～30個重復單位，大約每100 000 bp中出現一個[7]。MSI是指經遺傳異常狀態，這種狀態下，與正常細胞相比，微衛星的等位基因在基因組的增加或缺失的重復單元頻率更高[8]。MSI狀態是通過腫瘤與正常組織DNA進行比較確定的，其結果根據改變的微衛星序列的數目進行分類。如果改變是存在于兩個或兩個以上的五個微衛星序列中，該腫瘤被歸類為高MSI(MSI-H)；如果只有一個標記被突破，則被劃分為低MSI(MSI-L)；沒有變化的五個微衛星之間存在的腫瘤則被認為是微衛星穩定(MSS)[9]。MSI作為最早應用于實驗室篩查遺傳性非息肉病性大腸癌的分子標記，其敏感性為100%，特異性在90%以上[10]。

LOH是基因組中很常見的一種基因組改變，其發生是由于一個等位基因的雜合性缺失，或母系或父系的染色體或染色體區與其他等位基因同時缺失的重疊。根據不同的拷貝數狀態，雜合性缺失包括復制中立的、復制丟失的和復制增加的[11]。目前已經證實，LOH是多種腫瘤的重要遺傳事件，且在正常細胞中由于節段性異倍性已經顯示出純合性的純合子等位基因或其他機制[12]。

已有研究表明，大多數腫瘤癌旁正常組織中的基因組存在不穩定性，是提高IDC風險的潛在標志物[13]。目前DCIS、IDC有關LOH的多是通過比較病變組織與配對的鄰近或遠處正常組織的LOH進行[14]，并提出假設，組織學上正常的組織基因也正常。然而這種假設并不成立，因為一些證據已證實LOH發生在形態學和組織學均正常的早期乳腺癌患者的正常乳腺組織中[15～17]。本研究結果顯示，位于17p12區的D17S261以及位于17p13區的D17S796在乳腺普通型增生發展為乳腺癌的過程中出現了明顯的LOH與MSI改變。提示在乳腺癌中17p染色體上LOH/MSI出現了高頻改變。而在乳腺普通型增生發生時，提前關注17p染色體部分位點的突變可預測其發展為乳腺癌的可能性。

本研究結果提示，17p染色體的遺傳學不穩定是乳腺癌發生的前奏，D17S261、D17S796位點突變在UDH向IDC演變過程中可能起到關鍵作用。提示臨床可通過檢測正常乳腺組織或良性病變乳腺組織D17S261、D17S796位點突變情況預測乳腺癌發生的可能性并進行預防。但該位點突變是作為獨立因素還是與其他位點協同作用參與乳腺癌的發生，以及是否可作為評估乳腺癌發生風險的獨立因素，還有待大量的研究證實。

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貴州省科學技術基金資助項目(黔科合J字2278)；貴州省社會發展攻關項目(黔科合SY字3016)。

徐澍(E-mail： xushu@gmc.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.013

R737.9

A

1002-266X(2017)24-0043-03

2016-06-03)