口蝦蛄提取物對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP增殖、耐藥的影響及機制

邵松軍，方海燕,段玲弟，袁國航，張湘燕,郭兵

(1貴州醫科大學附屬省人民醫院，貴陽 550002；2貴州醫科大學；3貴州省第二人民醫院)

·論著·

口蝦蛄提取物對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP增殖、耐藥的影響及機制

邵松軍1,2，方海燕3,段玲弟2，袁國航1，張湘燕1,郭兵2

(1貴州醫科大學附屬省人民醫院，貴陽 550002；2貴州醫科大學；3貴州省第二人民醫院)

目的 觀察口蝦蛄乙酸乙酯提取物(ESO)對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP增殖、耐藥的影響，并探討其機制。方法 選取人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP，用不同濃度(0、200、400、800 μg/mL)的ESO干預細胞，24 h后，采用MTT法測算細胞增殖抑制率，流式細胞技術測算細胞周期百分率。采用流式細胞技術觀察400 μg/mL ESO干預0、30、60 min細胞內熒光染料羅丹明123(Rh123)蓄積和外排情況。采用Western blotting法檢測不同濃度ESO干預24 h后細胞多藥耐藥蛋白1(MDR1)，并檢測400 μg/mL ESO干預2、4、8 h后細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白。結果 200、400、800 μg/mL的ESO干預細胞增殖抑制率分別為19.940%±0.041%、37.360%±0.024%、42.510%±0.008%，兩兩相比P均<0.01。0、200、400、800 μg/mL ESO干預細胞G2/M期分別為24.06%±2.22%、31.10%±0.79%、35.64%±1.15%、43.19%±0.43%，兩兩相比P均<0.01。Rh123在ESO干預細胞內積累增多、外排減少，且60 min時較30 min時明顯(P均<0.01)。0、200、400、800 μg/mL ESO干預細胞MDR1蛋白相對表達量分別為1.22±0.23、0.83±0.16、0.37±0.09、0.31±0.04，兩兩相比P均<0.01。ESO干預不同時間A549/DDP細胞ERK1/2蛋白表達無變化，p-ERK1/2蛋白表達上調(P均<0.01)。結論 ESO通過使A549/DDP細胞發生周期阻滯，從而抑制其增殖；通過調節MAPK-ERK1/2信號通路，使其多藥耐藥發生逆轉。

口蝦蛄；非小細胞肺癌；多藥耐藥1；細胞外調節蛋白激酶1/2蛋白

肺癌發病率高，其中非小細胞肺癌占75%～85%[1]。目前化療藥物靶向性差，容易產生耐藥，治療效果并不顯著。因此，尋找天然、高效、低毒、低價的抗腫瘤藥物對腫瘤的防治和治療、提高中晚期腫瘤患者的生存質量意義重大[2]。口蝦蛄俗名瀨尿蝦，是極為常見的一種海洋生物。既往研究[3～6]發現，口蝦蛄的乙醇粗提取物、乙酸乙酯提取物(ESO)對鼻咽癌細胞株有明顯的增殖抑制作用，抑制作用主要與口蝦蛄中的生物堿和蛋白多肽類物質有關。但口蝦蛄提取物是否有廣譜抗癌的特性，是否對耐藥的肺癌細胞增殖有抑制作用，是否對耐藥的肺癌細胞有多藥耐藥逆轉效應未見報道。2015年12月～2016年12月，本研究觀察了ESO對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的增殖、耐藥的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑 胎牛血清、DMEM/High Glucose細胞培養基購于Gibco公司，順鉑購于齊魯制藥有限公司，DMSO、MTT購于Sigma公司，多藥耐藥蛋白1(MDR1)抗體購于Santa生物技術有限公司，p-ERK1/2、ERK1/2抗體購于Cell Signaling Technology生物技術有限公司。

1.2 ESO提取及配置 于廣東湛江東風市場購新鮮的口蝦蛄80 kg，用烘箱烘干，高效粉碎機粉碎后稱重。采用濕法提取口蝦蛄抗腫瘤有效活性成分。先以95%食用乙醇浸泡數次，直到浸泡液顏色變澄清。每次浸泡48 h，每3 h攪拌1次，共用乙醇溶液60 L，浸泡液用離心機離心留取上清液。將浸泡液混勻，然后用旋轉蒸發儀在56 ℃恒溫下旋轉蒸發，得到乙醇粗提取物。乙醇粗提取物按1∶3加水，在60 ℃下攪拌，待分液漏斗中有乳濁液分層出現，向其加入一半體積的乙酸乙酯，充分震蕩、靜置數分鐘到數小時；待明顯分層后，打開分液漏斗旋塞，將下層乳濁液流入燒杯中，上層黃色澄清溶液即為乙酸乙酯萃取層，黃色澄清溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮得到黃褐色膏狀物，即為乙酸乙酯提取物。共得到乙醇粗提取物1.7 kg，乙酸乙酯提取物0.14 kg，口蝦蛄提取物提取率為0.175%[6]。采用DMSO將ESO配置成1 g/mL母液,分裝于4 ℃冰箱保存，臨用前用含血清的培養基稀釋成所需終濃度(0、200、400、800 μg/mL)。處理細胞時，DMSO的最終濃度小于0.1%，該濃度不引起細胞生物學性狀改變。

1.3 細胞株來源及培養 人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP由廣東醫科大學附屬醫院中心實驗室惠贈，最大耐藥倍數2.47。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養A549/DDP，用終濃度為1.2 μmol/L的順鉑維持其耐藥性。在溫度為37 ℃、含5% CO2的培養箱培養，用0.25%含DTT的胰蛋白酶消化、傳代細胞，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。取對數生長期A549/DDP細胞接種于96孔培養板，每孔約含5 000個細胞；空白對照為不含細胞的等量完全培養基。待細胞貼壁后，陰性對照中僅加入等體積的培養基，干預組中各孔分別加入終質量濃度為200、400、800 μg/mL的ESO。每個濃度設5個復孔。培養24 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h。棄掉培養液，每孔加入150 μL的DMSO，平板搖床低速振蕩10 min，酶標儀570 nm波長下測定其吸光度(A)值，實驗重復3次。細胞抑制率(%)=[1-(干預組A值-空白對照A值)/(陰性對照A值-空白對照A值)]×100%。

1.5 細胞周期檢測 采用流式細胞術。取對數生長期的A549/DDP細胞(1×106/孔)，置于6孔板中，待細胞貼壁、鋪滿后，予不同濃度(0、200、400、800 μg/mL)ESO干預后繼續培養24 h。胰酶消化，離心(1 000 r/min)，PBS洗2次，-20 ℃預冷的70%乙醇固定，置于4 ℃冰箱過夜保存。取出固定細胞樣本，離心(1 500 r/min)棄乙醇，PBS洗2次，將細胞重懸于0.2 mL冷PBS中，然后加入0.5 mL已配好的碘化丙啶(PI)染色液，置于4 ℃冰箱避光染色30 min，350目尼龍膜過濾。用流式細胞儀測定各組細胞DNA的含量，然后用細胞周期分析軟件進行分析，得出細胞周期百分率。

1.6 細胞MDR1蛋白功能活性檢測 采用流式細胞術檢測羅丹明123(Rh123)在細胞內積累、外排的熒光強度，以代表MDR1蛋白的轉運功能。Rh123的激發波長507 nm，發射波長529 nm。實驗分為陰性對照組及干預組，取對數生長期的A549/DDP細胞(1×106/孔)，置于6孔板中，用含有5 μmol/L的Rh123培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養0、30、60 min。每個時間點離心收集細胞，用冷PBS洗2遍，然后重懸于0.5 mL冷的PBS中，置于冰上，采用流式細胞儀檢測Rh123的熒光峰。干預組需在不含Rh123培養液中加入400 μg/mL的ESO，余處理同前。

1.7 細胞MDR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白檢測 采用Western blotting法。檢測不同濃度(0、200、400、800 μg/mL)ESO干預24 h后細胞MDR1蛋白；檢測400 μg/mL ESO干預2、4、8 h后細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白。提取總蛋白，樣品進行SDS-PAGE后轉膜。轉膜條件為300 mA、恒電流90 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，然后加入1 mL一抗MDR1(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。分別加入2 mL二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發光液發光成像，用凝膠圖像分析軟件分析灰度值。

2 結果

2.1 不同濃度ESO干預細胞增殖抑制率比較 200、400、800 μg/mL的ESO干預細胞增殖抑制率分別為19.940%±0.041%、37.360%±0.024%、42.510%±0.008%，兩兩相比P均<0.01。

2.2 不同濃度ESO干預細胞周期百分率比較 見表1。

表1 不同濃度ESO干預細胞周期百分率比較

注：與0 μg/mL相比，*P<0.01；與200 μg/mL相比，▲P<0.01；與400 μg/mL相比，#P<0.01。

2.3 各組細胞Rh123積累、外排的熒光強度比較 見表2。

2.4 不同濃度ESO干預細胞MDR1蛋白表達比較 0、200、400、800 μg/mL的ESO干預細胞MDR1蛋白相對表達量分別為1.22±0.23、0.83±0.16、0.37±0.09、0.31±0.04，兩兩相比P均<0.01。

表2 各組細胞Rh123積累、外排的熒光強度比較

注：與陰性對照組相比，#P<0.01；與干預組0 min時相比，*P<0.01；與干預組30 min時相比，▲P<0.01。

2.5 ESO干預不同時間細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較 見表3。

表3 ESO干預不同時間細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較

注：與0 h時相比，*P<0.01；與2 h時相比，▲P<0.01；與4 h時相比，#P<0.01。

3 討論

肺癌是目前全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[7]。2012年,我國肺癌病死率和發病率均位列惡性腫瘤第一,年發病和死亡病例為70.5萬和56.9萬[8]。腫瘤化療研究進展提示，各類化療藥物通過對細胞周期調控，誘導腫瘤細胞凋亡，以達到控制腫瘤增殖的目的[9]。大量臨床研究數據表明，采用單一化療藥物治療肺癌效果并不顯著，且易產生耐藥。雖已經開發了針對MDR1蛋白靶點的分子靶向藥物，但因其不良反應多，易發生耐藥，而退居二線。

中藥臨床療效明顯，其不良反應少，在逆轉腫瘤的多藥耐藥方面已成為研究熱點，中藥單體及多種成分均具有逆轉肺癌多藥耐藥的作用[10～12]。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥的同時,對之前未接觸過的多種抗腫瘤藥物同樣產生耐藥。腫瘤細胞產生耐藥是中晚期癌癥患者治療失敗的主要原因，耐藥分子機制十分復雜，涉及膜轉運蛋白介導的藥物外排泵機制、相關耐藥蛋白過表達、酶類介導的腫瘤細胞解毒及修復功能增強、凋亡調控基因異常、信號轉導因子發揮抗凋亡機制、腫瘤干細胞靶點表達缺失等多種因素[13～15]。有學者認為細胞間黏附作用介導腫瘤耐藥，但多數學者認為腫瘤耐藥主要與MDR1蛋白在腫瘤細胞中過度表達并介導藥物外排有關。本研究結果發現，ESO對A549/DDP細胞增殖有抑制作用，且隨著ESO濃度的增加作用不斷增強。既往研究表明，ESO通過阻滯細胞周期S期而抑制細胞有絲分裂，從而抑制肝癌細胞增殖。何欣等[16]發現丹參酮ⅡA能顯著降低腫瘤患者體內MDR1蛋白、TOPOⅡ的表達，從而提高抑瘤率及腫瘤細胞的凋亡率。劉盛楠等[17]發現白藜蘆醇能夠抑制肺癌細胞A549的生長，誘導其凋亡。ESO對A549/DDP細胞增殖抑制，是否與細胞周期阻滯及促進其凋亡有關？本研究采用流式細胞技術對其細胞周期進行檢測，結果發現，經ESO干預的A549/DDP細胞，其G2/M期發生周期阻滯，隨著ESO濃度的增加阻滯作用不斷增強。可見，ESO主要通過調控A549/DDP細胞周期，從而抑制其增殖。

唐曉勇等[18]發現浙貝母堿對A549/DDP有多藥耐藥的逆轉作用,其可能是通過截斷細胞外膜肺耐藥相關蛋白(LRP)的胞內藥物外排泵功能及誘導細胞凋亡，從而發揮逆轉腫瘤多藥耐藥活性的作用。Li等[19]發現，胡椒堿對A549/DDP有明顯的增敏作用，且能逆轉其多藥耐藥，逆轉倍數達14.4倍，其逆轉機制可能與抑制多藥耐藥蛋白、多藥耐藥相關跨膜蛋白(MRP)的表達，從而增加細胞內化療藥物的蓄積或減少清除，并下調ABCG2、ABCB1等耐藥基因的表達有關。本研究結果顯示，Rh123在ESO干預A549/DDP細胞內積累增多、外排減少，且60 min時較30 min時明顯，可見ESO可以在細胞內蓄積或清除減少，實現耐藥逆轉。本研究結果發現，A549/DDP耐藥細胞經ESO干預后，MDR1蛋白表達下調,隨ESO濃度的增加蛋白下調更明顯。而ESO干預不同時間A549/DDP細胞ERK1/2蛋白表達無變化，p-ERK1/2蛋白表達上調，表明MAPK-ERK信號通路激活，調節了ESO對細胞的敏感性，其機制有待進一步研究。下一步我們將采用qRT-PCR檢測MDR1基因表達，以及敲低或RNA干擾MDR1基因，或使用MDR1基因及ERK1/2信號通路抑制劑進行干預，或加入ATP酶活性抑制劑干預，檢測MRP、乳腺癌耐藥蛋白、LRP等多個耐藥蛋白表達，進一步探討ESO與耐藥逆轉的關系，明確其作用機制。

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Effects of ESO extracts on proliferation and drug resistance of human lung adenocarcinoma drug-resistant cell line A549/DDP

SHAOSongjun1,FANGHaiyan,DUANLingdi,YUANGuohang,ZHANGXiangyan,GUOBing

(1GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China)

Objective To observe the effects of ethyl acetate extracts of Squilla oratoria (ESO) on proliferation and drug resistance of human lung adenocarcinoma drug-resistant cell line A549/DDP and to investigate its mechanism. Methods We selected the A549/DDP cell line, which were treated with different concentrations of ESO (0, 200, 400, 800 μg/ml) for 24 h. The proliferation inhibition rates of A549/DDP cells were detected by MTT assay. The cell cycle percentage was determined by flow cytometry (FCM). We used FCM to detect the Rhodamine123 (Rh123) accumulation and efflux in A549/DDP cells treated with 400 μg/mL ESO for 0, 30, and 60 min. After the cells were treated with different concentrations of ESO for 24 h, the multidrug resistance 1 (MDR1) protein was detected by Western blotting. Meanwhile, we detected the ERK1/2, p-ERK1/2 protein of cells after 400 μg/mL ESO treatment for 2, 4, and 8 h.Results The proliferation inhibition rates of A549/DDP cells treated with 200, 400, and 800 μg/mL ESO were 19.940%±0.041%, 37.360%±0.024%, and 42.510%±0.008%, and significant difference was found between every two groups (allP<0.01). A549/DDP cells treated with 0, 200, 400, and 800 μg/mL ESO could be blocked in G2/M phase, and the proliferation inhibition rates were 24.06%±2.22%, 31.1%±0.79%, 35.64%±1.15%, and 43.19%±0.43%, respectively; significant difference was found between every two groups (allP<0.01). ESO increased the accumulation of Rh123 level of A549/DDP cells, reduced the efflux, and this change was more significant at 60 min than at 30 min (allP<0.01). The expression of MR1 protein was 1.22±0.23, 0.83±0.16, 0.37±0.09, and 0.31±0.04 in A549/DDP cells after 0, 200, 400, 800 μg/mL of ESO treatment respectively, allP<0.01. However, p-ERK1/2 protein expression was up-regulated in A549/DDP cells (P<0.01), but p-ERK1/2 protein expression had no variation at different time of ESO treatment. Conclusion ESO inhibits the proliferation of A549/DDP cells through cell cycle arrest, and reverses the multidrug resistance by regulating the MAPK-ERK1/2 signaling pathway.

Squilla oratoria; non-small-cell lung cancer; multidrug resistance 1; extracellular signal-regulated kinase 1/2 protein

貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字2015-7126號)。

邵松軍(1984-)，男，碩士，主治醫師，主要從事肺癌的基礎與臨床研究。E-mail: 351224694@qq.com

張湘燕(1962-)，女，碩士，教授、主任醫師，主要從事肺癌的基礎與臨床研究。E-mail: zxy35762@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.001

R285.5

A

1002-266X(2017)22-0001-04

2017-02-22)