NECA對(duì)大鼠離體缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

王晴，周巖，韓會(huì)，汪鳳蘭，邢鳳梅

(華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山 063000)

NECA對(duì)大鼠離體缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

王晴，周巖，韓會(huì)，汪鳳蘭，邢鳳梅

(華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山 063000)

目的 觀察非選擇性腺苷受體激動(dòng)劑5′-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)對(duì)離體心肌缺血再灌注大鼠細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。方法 將42只Wistar大鼠隨機(jī)分為Sham組、I/R組、NECA組，各14只。Sham組心臟只穿線但不結(jié)扎缺血，用Kerbs-Henseleit緩沖液持續(xù)灌流170 min。I/R組、NECA組使用Langendorff裝置制備大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型，且NECA組再灌注前分別給予含NECA的灌流液。透射電鏡觀察各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變；Western blotting法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3的表達(dá)。結(jié)果 Sham組、NECA組透射電鏡下未見(jiàn)自噬體存在，但在I/R組可見(jiàn)多處典型的自噬現(xiàn)象。與Sham組相比，I/R組Beclin-1蛋白表達(dá)高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高(P均<0.05)。與I/R組相比，NECA組Beclin-1蛋白表達(dá)低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低(P均<0.05)。結(jié)論 NECA可通過(guò)降低大鼠心肌細(xì)胞自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

5′-N-乙基酰胺基腺苷；心肌缺血再灌注損傷；自噬

心肌缺血再灌注損傷涉及多種細(xì)胞分子機(jī)制，包括炎癥反應(yīng)、鈣超載、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡以及自噬等[1]。自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，正常情況下細(xì)胞的自噬水平較低。但在心肌缺血、再灌注過(guò)程中，心肌細(xì)胞自噬水平顯著上調(diào)，過(guò)度自噬導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，抑制過(guò)度的自噬活動(dòng)可有效減輕心肌細(xì)胞的損傷[2]，因此自噬成為研究心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的重要靶點(diǎn)。NECA是一種非選擇性腺苷受體激動(dòng)劑，能夠通過(guò)縮小梗死面積、減輕炎癥反應(yīng)、改善左心室功能來(lái)保護(hù)受損的心肌[3]。已有研究[4]證實(shí)，NECA可有效減少心肌缺血再灌注損傷，但保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。Beclin-1、LC3是心肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白。2015年8月～2016年3月,本研究觀察了NECA對(duì)大鼠離體缺血再灌注心肌細(xì)胞Beclin-1、LC3表達(dá)及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，探討NECA對(duì)大鼠離體缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，為臨床急性心肌梗死的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器 SPF級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量250～300 g，由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生長(zhǎng)環(huán)境：恒溫(18～24 ℃)、恒濕(45%～50%)、明暗交替各12 h，嚴(yán)格遵守國(guó)家頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則。NECA購(gòu)自英國(guó)TOCRIS公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自Beyotime生物技術(shù)研究所，兔源Beclin-1單克隆抗體、兔源LC3B單克隆抗體、兔源β-tubulin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)KPL公司。Langendorff灌流設(shè)備、多道生理信號(hào)采集設(shè)備購(gòu)自四川成都儀器廠，H-7650透射電子顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型制備方法 采用Langendorff心臟灌注模型法構(gòu)建大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，仰臥位固定，開(kāi)胸后迅速取出心臟懸掛在Langendorff灌流設(shè)備上進(jìn)行主動(dòng)脈逆流。將連有壓力傳感器的乳膠球囊放入左心室中，通過(guò)調(diào)節(jié)球囊內(nèi)溶液容量使左室舒張末壓保持在5～10 mmHg。待心臟穩(wěn)定20 min后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，造成心臟局部缺血。30 min后松開(kāi)，使缺血部位再灌注。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將42只Wistar大鼠隨機(jī)分為Sham組、I/R組、NECA組各14只。Sham組心臟只穿線但不結(jié)扎，用Kerbs-Henseleit緩沖液持續(xù)灌流170 min。其他2組制備大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型。I/R組再灌注2 h。NECA組再灌注2 h，于再灌注前5 min給予含0.1 μmol/L NECA的灌流液，至再灌注30 min時(shí)結(jié)束。

1.4 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察 取適量心肌組織，放于4 ℃的2.5%戊二醛溶液前固定，用磷酸鹽緩沖液清洗后再用1%鋨酸固定液進(jìn)行后固定。再次清洗后脫水，用100%丙酮與包埋液浸透包埋，聚合烤片，切片，滴加醋酸鈾染液和枸櫞酸鉛染色液進(jìn)行雙染色，通過(guò)透射電鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及有無(wú)自噬現(xiàn)象發(fā)生。細(xì)胞發(fā)生自噬的金標(biāo)準(zhǔn)：在電鏡下可觀察到心肌細(xì)胞在雙層膜或單層膜結(jié)構(gòu)內(nèi)出現(xiàn)包含細(xì)胞器的自噬泡[5]。

1.5 各組大鼠心肌細(xì)胞Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取適量心肌組織，提取蛋白，利用酶標(biāo)儀計(jì)算待測(cè)蛋白濃度，進(jìn)而確定蛋白上樣量，將蛋白分裝、變性。制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)的PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉。分別滴加兔源Beclin-1、LC3B一抗，4 ℃水平搖床過(guò)夜，用TBST洗膜，加入相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育1～2 h。再次洗膜后進(jìn)行顯色，以β-tubulin為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較 Sham組肌絲排列致密規(guī)則，肌節(jié)形態(tài)完整，嵴排列整齊。I/R組大部分肌絲斷裂、缺失，肌節(jié)攣縮，嵴排列稀疏甚至斷裂。NECA組的損傷較I/R組減輕，肌絲排列較規(guī)則，肌節(jié)輕度攣縮。Sham組、NECA組沒(méi)有自噬體存在，但I(xiàn)/R組存在多處典型的自噬現(xiàn)象，可見(jiàn)正在吞噬或者正在消化溶解的包裹著線粒體及其他細(xì)胞器的單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05。

3 討論

自噬是一種高度保守的細(xì)胞降解過(guò)程，可通過(guò)溶酶體降解內(nèi)容物來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝平衡[1]。自噬對(duì)細(xì)胞的影響是雙向的，適度的自噬可以幫助細(xì)胞對(duì)受損蛋白質(zhì)與細(xì)胞器進(jìn)行分解和再利用，但自噬程序過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。目前自噬在心肌缺血再灌注損傷中的研究結(jié)果不一致，通常認(rèn)為，自噬在心肌缺血階段起保護(hù)作用，但在再灌注階段會(huì)加重心肌損傷[2]。有研究[7]表明，心肌缺血再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的自噬特性，且在再灌注期間，自噬水平與心肌損傷程度呈正相關(guān)。因此，自噬可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的切入點(diǎn)。

目前，NECA已成為治療心肌梗死最有前景的藥物之一，但由于其保護(hù)作用機(jī)制尚不明確，在臨床上應(yīng)用受限[6]。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，NECA可有效減少心肌缺血再灌注所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而關(guān)于NECA對(duì)心肌缺血再灌注時(shí)自噬活動(dòng)的影響未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究重點(diǎn)探討NECA對(duì)心肌缺血再灌注自噬調(diào)控的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型，觀察到I/R組心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，有多處典型的自噬現(xiàn)象，說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷可以提高心肌細(xì)胞的自噬水平，這與Sciarretta等[1]的研究結(jié)果一致，證實(shí)了再灌注階段的過(guò)度自噬會(huì)加重心肌損傷。NECA組心肌細(xì)胞損傷明顯減輕，沒(méi)有自噬體的形成，僅有部分線粒體輕度水腫，推測(cè)NECA可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞的過(guò)度自噬而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Beclin-1是一種關(guān)鍵的自噬蛋白，是自噬發(fā)生的始動(dòng)因子，可調(diào)節(jié)自噬體的形成，直接反映自噬的發(fā)生程度[8]。有研究[1]證實(shí)，在心肌缺血再灌注損傷期間，Beclin-1表達(dá)升高標(biāo)志自噬程序被過(guò)度激活，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞死亡。LC3是自噬相關(guān)蛋白，是自噬起始階段的一種特殊的分子標(biāo)志物，LC3Ⅰ為未脂質(zhì)化的非活性狀態(tài)，LC3Ⅱ?yàn)橹|(zhì)化的活性狀態(tài)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ反映自噬的激活狀態(tài)[9]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷時(shí)LC3Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高，說(shuō)明缺血再灌注能增加自噬的發(fā)生。與I/R組相比，NECA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低，說(shuō)明NECA可通過(guò)降低缺血再灌注引起的大鼠心肌細(xì)胞自噬增高而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20090548)。

邢鳳梅(E-mail: 598461347@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.009

R331.3

A

1002-266X(2017)22-0028-03

2016-12-16)