非酒精性脂肪性肝病患者PNPLA3基因rs139051 C＞ T多態性分析

李暉，鄭丹，姜挺，吳杰

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院，武漢 430000)

非酒精性脂肪性肝病患者PNPLA3基因rs139051 C＞ T多態性分析

李暉，鄭丹，姜挺，吳杰

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院，武漢 430000)

目的 觀察非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者patatin樣磷脂酶域3(PNPLA3)基因rs139051 C>T多態性。方法 將100例NAFLD患者作為觀察組，同時選取100例健康志愿者作為對照組，使用PCR-LDR對兩組PNPLA3基因rs139051行單核苷酸多態性分型，采用logsitic回歸分析rs139051基因型與ALT、血糖、甘油三酯、膽固醇、肝臟纖維化程度指標(NFS評分、Fibroscan分級)的關系。結果 觀察組、對照組PNPLA3基因rs139051 CC基因型分別為10、39例，TC基因型分別為48、24例，TT基因型分別為42、37例，兩組相比P均<0.01。相對于CC基因型，TC+TT基因型ALT、血糖、甘油三酯、膽固醇、NFS評分、Fibroscan分級的OR(95%CI)分別為1.94(0.50～7.50)、2.33(0.60～9.08)、4.00(1.04～15.32)、1.11(0.27～4.65)、4.29(1.12～16.52)、4.93(1.27～19.13),P分別為0.34、0.22、0.04、0.88、0.03、0.02。結論 NAFLD患者中PNPLA3基因rs139051基因型TC、TT比例高，且更易促進NAFLD進展。

patatin樣磷脂酶域3；單核苷酸多態性；非酒精性脂肪性肝病；危險因素

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括單純脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝炎相關肝硬化及肝細胞癌[1～3]。近年來NAFLD的發病率不斷上升[4～7]，發病機制十分復雜，除了環境因素、肥胖、胰島素抵抗外，基因變異也起到十分重要的作用[8]。patatin樣磷脂酶域3(PNPLA3)是一種編碼481氨基酸的非分泌性蛋白，在甘油三酯的水解中發揮重要作用，在肝臟中高表達[9]。在NAFLD的基因突變中，PNPLA3基因rs738409[10]、rs139051[11,12]的突變備受關注，rs139051在亞洲人群中的相關研究較少，在NAFLD中的具體作用尚存在爭議。2015年2月～2016年2月，本研究分析了NAFLD患者PNPLA3基因rs139051 C>T的多態性，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年2月～2015年2月入住武漢市中心醫院的NAFLD患者100例，設為觀察組，其中男65例、女35例，年齡(42.7±9.8)歲。納入標準：影像學診斷確定脂肪肝表現，如肝實質回聲彌漫性增大等，同時肝臟穿刺病理活檢確定具有NAFLD病理特征。排除標準：感染HBV、HCV者；每日飲酒量≥20 g；患有其他肝臟疾病如自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、血色病、Wilson病、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎。同時隨機選取100例健康志愿者，設為對照組，其中男50例、女50例，年齡(43.2±10.3)歲。納入標準：超聲檢查無脂肪肝表現；肝生化指標正常；每日飲酒量<20 g；無糖尿病、高血壓等代謝綜合征。所有試驗對象簽署知情同意書，本研究征得醫院倫理委員會批準。

1.2 PNPLA3基因rs139051 C>T多態性觀察方法 PNPLA3基因rs139051基因分型由上海天昊生物科技有限公司完成。使用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取所有研究對象血液樣本。測序方法使用PCR-LDR方式，在rs139051C>T位點兩側設計PCR引物，上下游分別為5′-TAGCAGAGAAAGCCGACTTA-3′，5′-GCCCATGGGTCTCATCTATT-3′。PCR擴增使用NEB公司Q5高保真PCR酶，反應條件98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s、62 ℃ 20 s、72 ℃ 25 s共30個循環，72 ℃ 2 min，產物長度為280 bp，瓊脂糖電泳確定條帶大小后與基因多態性位點的特異性探針連接，并使用ABI3730 XL DNA測序儀檢測基因分型，基因型包括TT、TC和CC型。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗。將觀察組患者ALT、甘油三酯、血糖、膽固醇、NFS評分(肝臟纖維化程度指標)分別取平均值，高于平均值即認為表達量高。rs139051基因型與ALT、血糖、甘油三酯、膽固醇、NFS評分、Fibroscan分級(將肝臟纖維化劃分為F0、F1、F2、F3、F4五個等級，其中F0為無肝纖維化、F1為輕度肝纖維化、F2為中度肝纖維化、F3為重度肝纖維化、F4則為肝硬化)的關系使用logsitic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組PNPLA3基因rs139051 C>T多態性觀察結果 見表1。

表1 兩組PNPLA3基因rs139051 C>T多態性觀察結果

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.2 觀察組rs139051基因型與臨床進展相關指標的關系 見表2。

表2 觀察組rs139051基因型與臨床進展相關指標的關系

3 討論

NAFLD的發病因素除環境因素、肥胖、胰島素抵抗外，PNPLA3占據十分重要的作用[13]。PNPLA3位于染色體22號位長臂1區3帶3亞帶1次亞帶，編碼的蛋白稱之為脂肪滋養蛋白，是一種與脂肪降解相關的、主要在肝臟中表達的基因，能夠分解甘油三酯[14]和拮抗乙酰轉移酶[15]的活性，與體內脂肪的儲存、能量代謝的水平密切相關。研究發現，PNPLA3特定位點的點突變能顯著影響PNPLA3的功能活性[16]，其中最重要的突變為rs738409位點的突變。rs738409位點中CG的突變引發翻譯蛋白的錯義變異，將148位異亮氨酸突變為蛋氨酸，導致PNPLA3脂肪酶的活性消失，從而大幅增加患者發生NAFLD的風險。rs738409突變還被證實與肝臟脂肪變性、炎癥、纖維化和腫瘤相關，且該因素獨立于患者的年齡、性別、BMI和穩態模型評估指數。研究[17]發現，PNPLA3的突變能夠增加肝損指數但是與胰島素抵抗的發生無關。PNPLA3在不同人群具有異質性，在不同地區不同種族的成人中，PNPLA3基因的多態性均與肝臟炎癥相關，一些研究也認為與不同種族間NAFLD易感性以及發生率相關，其中在歐美人群中的作用且與丙型肝炎病毒效應之間的關系已被廣泛認識。亞洲人群與歐美人群在基因表型、藥物反應性、免疫系統方面均不同，PNPLA3目前在亞洲人群的研究較少[18]。與rs738409 不同，rs139051的突變位點位于內含子中，不引起PNPLA3功能的改變，通常認為并不能對PNPLA3基因功能產生決定性影響。但rs139051位點的A>G突變被證實能夠顯著影響PNPLA3翻譯，且與NAFLD活動積分中的脂肪變性、小葉炎癥密切相關。Liu等[19]認為，rs139051 A>G并不能夠獨立影響NAFLD的疾病風險，而Peng等[12]認為rs139051 TT基因型與NAFLD發病顯著相關。

本研究結果表明，觀察組PNPLA3基因rs139051的TC、TT基因型高于對照組，其中TC+TT基因型在觀察組中占90%，在對照組則僅為63%，表明NAFLD患者TC+TT基因型比例高。logistic回歸分析結果顯示，在NAFLD患者中，與常見純合子基因型CC相比，TC+TT基因型ALT、甘油三酯、膽固醇OR均>1且P>0.05，表明以上指標與NAFLD不相關，而在血糖指標中，OR>1且區間>1，表明TC+TT與血糖呈正相關，該結果與之前研究[12]結果不同。本研究在分析肝臟纖維化程度指標NFS評分和Fibroscan分級發現，與常見純合子基因型CC相比，TC+TT基因型OR分別為4.29、4.93，且區間>1，P均<0.05，表明TC+TT基因型為肝臟纖維化的危險性因素，能夠促進NAFLD的進展。

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吳杰(E-mail: wujiezxhospital@hotmail.com)

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R575.1

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