椎間盤(pán)退變患者髓核組織中HtrA1的表達(dá)及其與MMPs的關(guān)系

岳佳偉，李大鵬，吳燕，黃永輝

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

椎間盤(pán)退變患者髓核組織中HtrA1的表達(dá)及其與MMPs的關(guān)系

岳佳偉1，李大鵬1，吳燕2，黃永輝1

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察椎間盤(pán)退變患者髓核組織中高溫必需因子A1(HtrA1)的表達(dá)及其與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的關(guān)系。方法 78例接受椎間盤(pán)髓核切除患者，其中年輕脊柱骨折患者(改良Thompson分級(jí)Ⅰ級(jí))10例，椎間盤(pán)退變患者68例(改良Thompson分級(jí)Ⅱ級(jí)22例、Ⅲ級(jí)24例、Ⅳ級(jí)22例)。采用real-time PCR和Western blotting法分別檢測(cè)椎間盤(pán)髓核組織中的HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA和蛋白，并采用Pearson法分析HtrA1和MMP-1、3、7、9、13的相關(guān)性。結(jié)果 改良Thompson分級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者椎間盤(pán)髓核組織中HtrA1 mRNA分別為0.56±0.49、0.70±0.45、1.47±0.86、4.10±1.17，蛋白分別為0.16±0.09、0.52±0.07、1.21±0.26、3.10±0.17，兩兩相比P均<0.05。不同改良Thompson分級(jí)患者椎間盤(pán)髓核組織中MMP-1、3、13的mRNA、蛋白表達(dá)兩兩相比P均<0.05。HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r2分別為0.144 8、0.240 6、0.869 5，P均<0.01)。結(jié)論 椎間盤(pán)髓核組織中HtrA1的表達(dá)隨椎間盤(pán)退變程度的升高而升高，且與MMP-1、3、13的表達(dá)有關(guān)。

椎間盤(pán)退變；高溫必需因子A1；基質(zhì)金屬蛋白酶

椎間盤(pán)退行性疾病是臨床上常見(jiàn)病，發(fā)病趨于年輕化，是導(dǎo)致頸肩腰腿痛的一個(gè)重要原因，椎間盤(pán)退變是椎間盤(pán)退行性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，多種因素均可促進(jìn)椎間盤(pán)退變的發(fā)生[2]，但具體的細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚。髓核是椎間盤(pán)的重要組成部分，由髓核細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。髓核中的細(xì)胞外基質(zhì)處于合成代謝與分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)分解過(guò)多時(shí)，髓核的水分將會(huì)流失，固有的彈性也將喪失，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤(pán)生物力學(xué)功能減退[3]。高溫必需因子A1(HtrA1)為絲氨酸蛋白酶家族成員，是一種分泌蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組需要Zn2+、Ca2+等金屬離子作為輔助因子的同工酶，其功能為參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，具有減少細(xì)胞外和基膜組分的作用。MMPs的上調(diào)可導(dǎo)致髓核變性，從而引起相應(yīng)的椎間盤(pán)病變[5]。目前研究較多的參與椎間盤(pán)退變過(guò)程的MMPs為MMP-1、3、7、9、13。關(guān)于HtrA1在椎間盤(pán)退變中的作用目前研究較少，因此本研究觀察了不同改良Thompson分級(jí)椎間盤(pán)髓核組織中HtrA1的表達(dá)情況，并探討其與MMP-1、3、7、9、13表達(dá)的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年1月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院行椎間盤(pán)髓核切除者78例，其中年輕脊柱骨折患者(改良Thompson分級(jí)Ⅰ級(jí))10例，椎間盤(pán)退變患者68例(改良Thompson分級(jí)Ⅱ級(jí)22例、Ⅲ級(jí)24例、Ⅳ級(jí)22例)。所有患者術(shù)前無(wú)腫瘤、感染、炎癥等。手術(shù)中切取所有患者椎間盤(pán)髓核組織中央部分。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，并與患者簽訂知情同意書(shū)。

1.2 椎間盤(pán)髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用real-time PCR。取50～100 mg新鮮髓核組織，剪碎置入裝有1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司)的研磨器中，迅速研碎。移至1.5 mL無(wú)菌進(jìn)口EP管中，反復(fù)吹打，應(yīng)用異硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA。采用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的濃度，并按Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(18080-051)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。采用10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中包括總RNA 1 μL、MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、dNTP(各10 mmol/L)1 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL、OligodT 0.5 μL。采用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板，采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(DRR420A)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，于Tm值下退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。72℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔCt法分析HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 椎間盤(pán)髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取20～40 mg新鮮髓核組織，剪碎，加入1 mL預(yù)冷的RIPA(含PMSF)裂解液，超聲勻漿器勻漿后冰浴10 min，將勻漿液收集于EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清，采用Bradford法測(cè)定總蛋白濃度，并按比例加入含β-巰基乙醇的Buffer，于沸水煮變性后置-20 ℃保存。凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，滴加100 μL一抗[HtrA1兔單克隆抗體NBP2-23869(1∶500，Novusbio公司)、MMP-1兔單克隆抗體BS1229(1∶500，Bioworld Technology公司)、MMP-3兔單克隆抗體ab52915(1∶1 000，abcam公司)、MMP-7鼠單克隆抗體sc-8832(1∶200，Santa Cruz公司)、MMP-9鼠單克隆抗體ab58803(1:500，abcam公司)、MMP-13兔單克隆抗體ab39012(1∶3 000，abcam公司)]，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，滴加相應(yīng)二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，用TBST洗3次。滴加ECL發(fā)光劑顯色，于凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，運(yùn)用Image J軟件分析掃描結(jié)果，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同改良Thompson分級(jí)患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 不同改良Thompson分級(jí)患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表達(dá)比較

注：與Ⅰ級(jí)相比，▲P<0.05；與Ⅱ級(jí)相比，*P<0.05；與Ⅲ級(jí)相比，#P<0.05。

2.2 不同改良Thompson分級(jí)患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 不同改良Thompson分級(jí)患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表達(dá)比較

注：與Ⅰ級(jí)相比，▲P<0.05；與Ⅱ級(jí)相比，*P<0.05；與Ⅲ級(jí)相比，#P<0.05。

2.3 HtrA1與MMP-1、3、7、9、13表達(dá)的相關(guān)性 78例椎間盤(pán)髓核切除者髓核組織中HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r2分別為0.1448、0.2406、0.8695，P均<0.01)。

3 討論

椎間盤(pán)退變是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其疾病的病理機(jī)制歸因于組成細(xì)胞外基質(zhì)的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的流失[2]。HtrA1是一種具有熱休克蛋白性質(zhì)的膜絲氨酸蛋白，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)的該酶家族成員，最初在肉毒病毒40成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。HtrA1絲氨酸蛋白酶的研究多見(jiàn)于腫瘤方面[6]。也有相關(guān)研究[3,7]發(fā)現(xiàn)，HtrA1在骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)量增加，在骨關(guān)節(jié)炎中起重要的調(diào)控作用。同時(shí)，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HtrA1啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性與椎間盤(pán)退變相關(guān)[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著改良Thompson分級(jí)級(jí)數(shù)的升高，HtrA1 mRNA、蛋白在椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)不斷升高，表明HtrA1可能參與椎間盤(pán)退變的過(guò)程。

椎間盤(pán)的退變始于髓核，MMPs等降解酶的表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致髓核細(xì)胞外基質(zhì)的降解加快[2]。沈正清等[9]發(fā)現(xiàn)，MMP-3可作為腰椎間盤(pán)退變的重要調(diào)節(jié)因子，參與退變進(jìn)程。正常椎間盤(pán)標(biāo)本沒(méi)有肉芽組織形成，凸出型及韌帶下型僅有較少肉芽組織，大多數(shù)游離型及經(jīng)韌帶脫出型有肉芽組織，纖維環(huán)和髓核中的肉芽組織形成越多，MMP-1、3的表達(dá)就越強(qiáng)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著改良Thompson分級(jí)級(jí)數(shù)的升高，MMP-1、3的mRNA、蛋白在椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)不斷升高。胡峰等[11]發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)退變及突出越嚴(yán)重,MMP-7表達(dá)越強(qiáng)，說(shuō)明MMP-7與椎間盤(pán)的病理改變有關(guān)，MMP-7表達(dá)增加導(dǎo)致組織降解增強(qiáng)，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)退變。亦有研究[12]表明，MMP-9在正常髓核內(nèi)有一定量的表達(dá)，在退變腰椎間盤(pán)髓核的表達(dá)成倍升高，說(shuō)明退變髓核組織中MMP-9代謝活躍，與椎間盤(pán)退變、突出密切相關(guān)。Omlor等[13]發(fā)現(xiàn)MMP-13基因表達(dá)在椎間盤(pán)退變過(guò)程中上調(diào)。亦有研究[14]發(fā)現(xiàn)，退變椎間盤(pán)的炎性因子可以上調(diào)MMP-13的表達(dá)，MMP-13的異常表達(dá)可導(dǎo)致椎間盤(pán)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解，推測(cè)MMP-13在椎間盤(pán)退變過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著改良Thompson分級(jí)級(jí)數(shù)的升高，MMP-13 mRNA、蛋白在椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)不斷升高，但不同改良Thompson分級(jí)椎間盤(pán)髓核組織中MMP-7、9表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有研究[15]發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠關(guān)節(jié)軟骨中增加的HtrA1與MMP-13有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。最近有研究表明，HtrA1能降解纖維連接蛋白，纖維連接蛋白的降解物則可增加MMPs的產(chǎn)量[7]。推測(cè)HtrA1與MMP-1、3、13可共同作用于椎間盤(pán)，引起相應(yīng)的椎間盤(pán)病變。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81601931)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20150475)；鎮(zhèn)江市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(SH2015085)。

黃永輝(E-mail: huangyh8855@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.031

R681.5

B

1002-266X(2017)22-0083-03

2016-11-09)