HPLC法測定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量

蔡 樂，白 林，范金釗，任 韡，黃曉舞

（解放軍總醫院藥學部，北京 100853）

·實驗研究·

HPLC法測定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量

蔡 樂，白 林，范金釗，任 韡，黃曉舞

（解放軍總醫院藥學部，北京 100853）

目的：建立HPLC法測定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量。方法：采用超聲提取方法處理魚肝油軟膏，用HPLC法進行含量測定。色譜柱為Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（98 : 2），流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：328 nm，柱溫：30 ℃。結果：維生素A在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范圍內線性關系良好（r = 0.999 9）；樣品平均回收率為99.78%（RSD = 1.57%）。結論：本方法簡便、準確、重復性好，可用于魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量測定。

魚肝油軟膏；維生素A醋酸酯；高效液相色譜法；含量測定

魚肝油軟膏為《解放軍醫療機構制劑規范》（2015年版）中收載的皮膚科外用制劑，由魚肝油和凡士林組成，具有營養、保護、潤滑及促進肉芽組織生長等作用，有助于傷口、燒傷及各種潰瘍的愈合。臨床中可用于慢性皮膚結核、皸裂、魚鱗病、皮膚干燥、外傷、燒燙傷、潰瘍及子宮頸炎等[1]。魚肝油主要含有維生素A類和維生素D類脂溶性維生素[2-3]，維生素A有多種分子形式，人工合成的維生素A主要為維生素A醋酸酯，其中全反式維生素A醋酸酯為活性成分，為控制魚肝油軟膏的質量，本研究建立了HPLC方法測定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站，美國Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）。

魚肝油軟膏（本院自制，規格1 0%，批號20161025，20161101，20161108）；維生素A醋酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100368-201301，每1 g中含維生素A醋酸酯343 mg，其中含全反式維生素A醋酸酯96.9%）；甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（98 : 2）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：328 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱定維生素A醋酸酯1.014 1 g，置于100 mL棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液A。精密移取儲備液A 1 mL置于50 mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液B。精密移取儲備液B 1.5 mL置于100 mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含相當于維生素A為2.939 4 U的對照品溶液（1 U維生素A = 0.344 μg全反式維生素A醋酸酯）。

2.2.2 供試品溶液 避光操作，取供試品適量（約相當于含魚肝油0.25 g），精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加無水乙醇約30 mL，于50 ℃水浴加熱超聲10 min，放至室溫，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，置于冰浴中冷卻1 h，取出后迅速濾過，放至室溫，精密量取續濾液4 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 另按處方比例及制備工藝，配制不含魚肝油的空白制劑，依“2.2.2”項下方法處理，制成陰性對照溶液。

2.3 系統適用性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按“2.1”項下色譜條件，各進樣10 μL，測定HPLC圖譜，考察供試品中全反式維生素A醋酸酯和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，全反式維生素A醋酸酯的保留時間約為10.0 min，全反式維生素A醋酸酯色譜峰峰形對稱尖銳，基線平穩，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品無干擾。具體見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取適量對照品儲備液，加流動相配制成含全反式維生素A醋酸酯濃度為0.587 9，1.469 7，2.939 4，4.409 1，5.878 8，7.348 5 U·mL-1的溶液。分別精密吸取各濃度溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），標準溶液濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得全反式維生素A醋酸酯的回歸方程為Y = 32.104 X + 0.798 2，r = 0.999 9。結果表明，全反式維生素A醋酸酯在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗

取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”色譜條件下，連續進樣6次測定，計算全反式維生素A醋酸酯的峰面積RSD（n = 6）為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

取同一供試品（批號20161101）約2.5 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，計算含量RSD為2.09%（n = 6），表明方法重復性良好。

2.7 穩定性考察

圖1 魚肝油軟膏的HPLC色譜圖A – 對照品溶液，B – 供試品溶液，C – 陰性對照溶液；1 – 全反式維生素A醋酸酯Fig 1 HPLC chromatograms of cod liver oil ointmentA – reference solution, B – test solution, C – negative reference solution; 1 – all-trans vitamin A acetate

取同一供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，分別于0、1、2、4、6、8 h進樣10 μL測定，計算全反式維生素A醋酸酯的峰面積RSD為1.23%（n = 6），表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.8 加樣回收率實驗

取“2.2.3”項下空白制劑9份，分成3組，每組3份，每份約2.5 g。分別精密加入一定量的對照品儲備液，按供試品溶液制備方法制成含量約為供試品標示量的80%、100%和120%的樣品溶液。依“2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號20161025、20161101、20161108），每批樣品測定3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，以外標法計算各個樣品中全反式維生素A醋酸酯的含量，結果見表2。

3 討論

3.1 質控指標的選擇

魚肝油是從無毒海魚肝臟中提取出并經適當工藝制成的一種脂肪油制劑，主要含有維生素A和維生素D。維生素A是調節上皮細胞分化生長的輔助因子，可催化黏多糖的合成以及維持上皮組織結構的完整性。維生素D也對維持上皮細胞功能具有一定的作用[4]。本研究曾考慮將維生素A和維生素D均作為魚肝油軟膏的質量控制指標，但經查閱文獻[5]和實驗發現，該制劑中維生素D含量較低（15 U·g-1），采用該方法測定時不可檢出，故只選用維生素A作為魚肝油軟膏的質控指標。《中國藥典》2015年版中維生素A的含量以單位（U）表示，因此本研究將反式維生素A醋酸酯的含量折算為單位標示。

表1 回收率實驗結果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2 魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量. n = 3Tab 2 Determination of contents of all-trans vitamin A acetate in cod liver oil ointment. n = 3

3.2 樣品處理方法的優化

本研究對樣品的提取溶劑進行考察，發現無水乙醇的提取率明顯高于流動相。為減小供試品溶液對色譜柱的損害，本研究在樣品提取后，先在冰浴條件下使部分輔料沉淀，濾過后再加入流動相進一步使輔料沉淀，最后用0.22 μm微孔濾膜濾過后進樣[6]。試驗發現，50 ℃水浴時充分振搖可完全提取樣品，因50 ℃超聲提取方法相對簡便且重現性更好，為此采用50 ℃下超聲處理作為提取方法。

3.3 含量范圍的確定

參考《中國藥典》2015年版，每1 g魚肝油應含維生素A 1350 ～ 1800 U（標示量的90.0% ～ 120.0%），設定魚肝油軟膏允許的投料范圍為90.0% ～ 110.0%，每1 g 10%魚肝油軟膏應含維生素A 121.5 ～ 198 U，即標示量的81% ～ 132%。為提高自制制劑的標準，本研究將自制制劑的內控標準設定為標示量的85% ～ 125%。

結果表明，本方法操作簡便，準確性高，重復性好，可作為魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯含量測定的方法。

[1] 中央軍委后勤保障部衛生局.中國人民解放軍醫療機構制劑規范（第一冊）[S].2015年版.北京：人民軍醫出版社，2016：191-192. [2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：686.

[3] 牛劍釗，黃海偉，張啟明.《中國藥典》2010年版魚肝油質量標準問題的探討和建議[J].中國藥品標準，2013，15（3）：163-164. [4] 廖二元.維生素D制劑的藥理機制與臨床應用[J].中南藥學，2003，1（2）：98-102.

[5] 馮國.反相高效液相色譜法測定維D2磷酸氫鈣片中維生素D2的含量[J].中國藥業，2013，22（12）：91-92.

[6] 蔡樂，白林，徐風華，等.HPLC法測定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量[J].中國藥物應用與監測，2014，11（2）：82-84.

Determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment by HPLC

CAI Le, BAI Lin, FAN Jin-zhao, REN Wei, HUANG Xiao-wu(Pharmaceutical Department of PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To establish the HPLC method for determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment. Methods: The Vitamin A acetate in ointment was extracted by ultrasonic method, and the content of all-trans Vitamin A acetate was determinated by HPLC method. HPLC was carried out on a column of Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisting of methanol-water (98 : 2). The fl ow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 328 nm. The column temperature was 30 ℃. Results: Vitamin A showed a good linear relationship in the range of 0.587 9 – 7.348 5 U·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 99.78% (RSD = 1.57%). Conclusion: The method is simple, accurate and repeatable, which is suitable for the content determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment.

Cod liver oil ointment; Vitamin A acetate; HPLC; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)03 – 0143 – 03

2016-11-22

2017-03-13）

解放軍總醫院臨床扶持基金（2012FC-CXYY-4008）

黃曉舞，女，副主任藥師，研究方向：藥物制劑與藥品質量控制。E-mail：huangxw301@163.com

蔡樂，男，副主任藥師，研究方向：醫院藥學、藥物分析。E-mail：caile15009@163.com