小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的影響

胡亞耘，董 慧

（1.武漢市第一醫院 內分泌科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學同濟醫院中西醫結合研究所，湖北 武漢 430030）

小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的影響

胡亞耘1，董 慧2

（1.武漢市第一醫院 內分泌科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學同濟醫院中西醫結合研究所，湖北 武漢 430030）

目的探討小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的影響及可能的作用機制。方法采用小檗堿干預后，用MTT法、放射免疫法及Western blotting確定小檗堿干預的合適濃度范圍及檢測NIT-1細胞胰島素水平和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）蛋白的表達。結果小檗堿在濃度為100 μmol/L時對基礎培養基和高糖培養基干預的NIT-1細胞的增殖存在顯著性抑制作用(P＜0.05)；而小檗堿在濃度為30 μmol/L時就明顯抑制高脂培養基誘導的NIT-1細胞的增殖(P＜0.05)。小檗堿分別對基礎、高糖和高脂誘導的NIT-1細胞短時相干預（1 h）后，顯示葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）被明顯抑制 (P＜0.05)；小檗堿對高糖高脂誘導的NIT-1細胞長時相干預（24 h）后顯示基礎胰島素分泌和GSIS均有一定的增加(P＜0.05，P＜0.01)。小檗堿可以促進高糖高脂誘導的NIT-1細胞AMPK蛋白的表達。結論小檗堿不僅僅作為一種AMPK激活來調節胰島素分泌，其也可能通過其他的通路進一步影響胰島素分泌。

小檗堿；NIT-1細胞；胰島素

本文引用：胡亞耘，董 慧.小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（7）：730-735.

在2型糖尿病的發病過程中，胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損作為兩個重要的發病環節參與其中[1]。在糖尿病前期，胰島β細胞一方面代償性分泌胰島素會引起機體的高胰島素血癥，另一方面當代償性分泌進展為失代償后，出現胰島β細胞功能受損，從而導致糖尿病的發生。這一點與2型糖尿病中胰島素分泌由相對不足最終逐漸進展為胰島素分泌絕對不足是相符合的。胰島β細胞的功能主要通過分泌胰島素從而起到調節血糖的作用；而目前促進胰島細胞分泌與釋放胰島素是磺脲類和格列奈類降糖藥物的主要作用機制[2]。但也有報道二甲雙胍及羅格列酮等降糖藥物通過激活AMPK途徑抑制胰島素分泌從而起到很好的降糖作用，一是可以增加胰島素的敏感性從而改善胰島細胞功能[3-5]，二是可以延緩胰島細胞功能的耗竭，保證正常功能的胰島細胞的數量。除了促進胰島細胞胰島素的分泌，保護胰島β細胞功能也有望成為糖尿病治療中的一個新的治療方向和研究熱點。

小檗堿（berberine），又被稱為黃連素，目前臨床上已被廣泛應用于2型糖尿病的治療，但其降糖調脂的作用機制還并未被完全闡明。已經證實小檗堿能通過改善脂肪細胞、肝細胞、骨骼肌細胞等外周組織的胰島素敏感性來實現治療2型糖尿病的功效[6]，而小檗堿對胰島β細胞胰島素的分泌及其功能的影響尚未闡明。前期有試驗提出小檗堿可作為胰島素促泌劑促進胰島素的分泌[7]。而Zhou L等[8]也得出小檗堿可能通過 AMPK途徑抑制胰島細胞胰島素的分泌的結論。因此，為明確小檗堿對β細胞功能的影響，我們采用軟脂酸和高糖分別誘導NIT-1細胞，進一步觀察小檗堿對NIT-1胰島β細胞胰島素分泌的急慢性調節作用和機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

小檗堿、腺苷酸活化蛋白激酶即AMPK激活劑（5-Aminoimidazole-4-carboxamide-β-D-ribofuranoside，AICAR）、腺苷酸活化蛋白激酶抑制劑即AMPK inhibitor(Compound C)、胰蛋白酶、軟脂酸（PA）、牛血清白蛋白（BSA），均購自美國 Sigma 公司；胎牛血清（FBS）、1640 培養基、DMEM 高糖培養基、二甲基亞砜，均購自美國Thermo公司；MTT試劑盒、血清胰島素放免試劑盒，均購自北方生物技術研究所（中國）。

1.2 細胞培養

NIT-1細胞為華中科技大學基礎醫學院的NIT-1細胞株的傳代細胞，將傳代后的細胞接種于細胞培養瓶，用分別含有100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，10%胎牛血清的1 640培養基在37℃、5%CO2培養箱內培養。NIT-1細胞生長到 70%～80% 融合后，棄原培養基，分別加入高糖或者高脂培養基中誘導24 h后建立高糖模型和高脂模型。

1.3 MTT實驗

采用MTT法檢測細胞增殖。將NIT-1細胞以1×105的密度接種于96孔板中，待細胞融合至60%～70%后，分別在完全培養基（空白對照組，Con）、高糖培養基（高糖模型組，Mod）和高脂培養基（高脂模型組，Mod）中培養，然后加入含有不同濃度的小檗堿（1 μmol/L，3 μmol/L，10 μmol/L，30 μmol/L，100 μmol/L）進行干預，其中每組各設定4個復孔。干預24 h后加入 5 g/L MTT 溶液 50 μL，在 37 ℃、5%CO2培養箱中放置4 h后，倒掉培養液，加入100 μL DMSO，混合均勻后，將酶標儀設定為490 nm檢測吸光度。

1.4 胰島素分泌實驗

將細胞以1×105的密度接種到24孔板中，待細胞生長至60%～70%融合后分別給予不同的培養基（完全培養基、高糖培養基、高脂培養基）培養24 h后予以干預，具體方法如下：棄去板中的培養基，用無糖的克林緩沖液（KRBH）[NaCl 118.5 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.54 mmol/L，KH2PO41.19 mmol/L，KCl 4.74 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，MgSO41.19 mmol/L，Hepes10 mmol/L，1 g/L 牛血清蛋白，pH 7.4]清洗 1次，然后再用相同濃度的KRBH預孵育30 min以使細胞處于基礎代謝狀態，棄去KRBH，再將各種條件不同的KRBH （含葡萄糖 2.8 mmol/L、含葡萄糖16.7 mmol/L、含小檗堿并同時含有葡萄糖 2.8 mmol/L或者16.7 mmol/L、含軟脂酸0.4 mmol/L、含小檗堿并同時含有軟脂酸 0.4 mmol/L）孵育1 h，收集上清液保存于-20℃待測，用放射免疫試劑盒測定。

1.5 AMPK蛋白表達測定

將NIT-1細胞用高糖高脂誘導24 h后提取蛋白，檢測蛋白濃度。每組各取總蛋白30 μg，分別經恒定電壓分離（100 V，2 h）和恒定電流（278 mA）進行轉膜45 min，轉膜至NC膜上后用TBST溶液在室溫環境中封閉2 h。加入一抗在4℃過夜，用TBST漂洗5次，每次10 min，然后加入二抗室溫反應1 h，TBST漂洗5次，每次10 min。最后用Odyssey系統掃描后進行分析。其中一抗為鼠抗AMPK（1∶4 000稀釋），二抗為熒光標記的兔抗鼠（1∶20 000稀釋）。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 MTT法檢測小檗堿對NIT-1細胞增殖的影響

結果表明，空白對照組：與對照組BBR 0 μmol/L相比，小檗堿在 1、3、10、30 μmol/L 時對細胞的增殖無明顯影響，在100 μmol/L時明顯降低NIT-1細胞的存活率 （P＜0.05）。高糖模型組：與對照組BBR 0 μmol/L相比，小檗堿在1 μmol/L時對細胞的增殖有促進作用，在3、10、30 μmol/L時細胞的增殖略有下降，小檗堿在100 μmol/L時細胞的存活率明顯下降 （P＜0.05）。高脂模型組：與對照組BBR 0 μmol/L相比，小檗堿在1、3、10 μmol/L時NIT-1細胞存活率略有下降，小檗堿在30、100 μmol/NIT-1細胞存活率明顯下降（P＜0.05）。 各組細胞吸光度見表 1。

表1 MTT法檢測小檗堿在不同培養基中對NIT-1細胞的增殖抑制作用 （n=4）

2.2 小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的影響

2.2.1 10 μmo/L小檗堿對NIT-1細胞基礎狀態、葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）和軟脂酸刺激胰島素分泌（PSIS）的影響

結果表明，與對照組相比，10 μmo/L小檗堿對NIT-1細胞基礎狀態、GSIS和PSIS均有抑制作用。見表2。

表2 10 μmo/L小檗堿對NIT-1細胞基礎狀態（Glu 2.8 mmol/L）、GSIS（Glu 16.7 mmol/L）和 PSIS（PA 0.4 mmol/L）的影響 （n=4，mu/L）

2.2.2 10 μmo/L小檗堿干預24 h對高糖誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的影響 結果表明，與模型組比較，小檗堿組的基礎分泌量和糖刺激分泌量均增加（P＜0.05，P＜0.01）； 陽性對照組即 AMPK 激動劑AICAR組的基礎分泌量減少（P＜0.01）；陰性對照組即AMPK抑制劑Compound C組糖刺激分泌量增加（P＜0.05）。 見表 3。

表3 10 μmo/L小檗堿干預24 h對高糖誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的影響 （n=4,mu/L）

2.2.3 10 μmo/L小檗堿干預24 h對高脂誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的影響 結果表明，與模型組比較，小檗堿組的基礎分泌量和糖刺激分泌量均增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照AMPK 激動劑AICAR組基礎分泌量和糖刺激分泌量均有一定降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)；陰性對照即AMPK抑制劑Compound C組基礎分泌量和糖刺激分泌量均增加（P＜0.05）。 見表 4。

表4 10 μmo/L小檗堿干預24 h對高脂誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的影響 （n=4,mu/L）

2.3 小檗堿對NIT-1細胞AMPK蛋白表達的影響

2.3.1 小檗堿對高糖誘導的NIT-1細胞AMPK蛋白表達的影響 將NIT-1細胞分為對照組、模型組、小檗堿組、陽性對照組（AICAR）、陰性對照組（Compound C）及雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）組。各組細胞分別給予完全培養基及含有小檗堿（10 μmol/L）、AICAR （0.5 mmol/L）、Compound C（10 μmol/L）、RAPA（50 nmol/L）的高糖培養基進行干預，干預24 h后運用Western-blot法檢測AMPK蛋白的表達。 結果表明，25 mmol/L葡萄糖作用24 h后，模型組的AMPK蛋白表達較對照組明顯降低 （P＜0.05，P＜0.01）； 而與模型組比較， 小檗堿、AICAR、RAPA均可以一定程度促進AMPK蛋白的表達 （P＜0.05，P＜0.01），Compound C 則抑制 AMPK蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖 1-2。

2.3.2 小檗堿對高脂誘導的NIT-1細胞AMPK蛋白表達的影響 將NIT-1細胞給予完全培養基及分別含有小檗堿（10 μmol/L）、AICAR（0.5 mmol/L）、Compound C（10 μmol/L）、RAPA（50 nmol/L）的高脂培養基干預24 h，采用Western-blot檢測AMPK蛋白的表達。結果表明，0.25 mmol/L軟脂酸作用24 h后，模型組的AMPK蛋白表達較對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，小檗堿、AICAR、RAPA均可以一定程度促進AMPK蛋白的表達 （P＜0.05，P＜0.01），Compound C 則抑制 AMPK 蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖 3-4。

圖1高糖誘導的NIT-1胰島細胞中各組AMPK蛋白的表達 （n=4）

圖2高糖誘導的NIT-1胰島細胞中各組AMPK蛋白的表達 （n=4）

圖3高脂誘導的NIT-1細胞各組AMPK蛋白的表達 （n=4）

圖4高脂誘導的NIT-1細胞各組AMPK蛋白的表達 （n=4）

3 討論

當今，伴隨著社會人口老齡化的發展、飲食結構的不合理、肥胖人數的增加，2型糖尿病（T2DM）發病率一直呈上升趨勢。T2DM發病的重要特征是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細胞功能不足。胰島素抵抗一方面是糖尿病進展和血糖難以控制的一個重要原因，另一方面因為代償性分泌胰島素也會導致殘存的胰島β細胞的數量和生理功能進一步降低最終失代償出現胰島β細胞功能的喪失，表現為胰島素分泌的絕對不足。因此降糖藥如何通過調節胰島β細胞胰島素的分泌，一方面穩定地控制血糖，另一方面能較好地保護胰島β細胞的功能也成為臨床治療糖尿病時的一個關注熱點。

小檗堿，又名黃連素，是中藥黃連的主要成份；黃連性苦味寒，具有清熱燥濕的療效。中醫學認為機體濕熱內蘊、耗傷陰津、陰虛燥熱從而導致消渴病，故黃連是我國中醫治療糖尿病的經典用藥。近年來小檗堿也廣泛應用于糖尿病的治療，并取得了肯定的療效。戴建峰等[9]試驗后提出，經黃連素治療后,2型糖尿病大鼠 “三多一少”癥狀明顯改善,血糖、血壓、血脂明顯降低。但現代醫學研究對小檗堿的降糖機制還并未完全闡明。小檗堿在外周組織可能是通過抑制肝臟的糖原異生和（或）促進葡萄糖酵解而發揮降血糖作用。在胰島細胞中，小檗堿對胰島素分泌的調節作用作為一種降糖機制也是研究熱點，王永剛等[10]提出黃連及其黃連素具有一定的降糖作用,并且推論黃連素和黃連總堿的降糖作用可能不是通過胰島素的分泌和釋放，而是通過受體后效應增加胰島素敏感性。到目前為止，小檗堿對胰島β細胞胰島素釋放和分泌的影響存在著無影響、促進分泌或抑制分泌這三種互相矛盾的報道，至今沒有定論[2]。

我們的前期試驗發現小檗堿可以通過促進胰島素分泌起到降糖作用。目前研究表明小檗堿是AMPK的激活劑[11-13]。在外周組織如肝臟、脂肪細胞和骨骼肌細胞中激活AMPK后對物質代謝起到了重要作用[14-17]；在胰腺組織中，邵莉等[16-19]人發現抑制AMPK活性可以促進胰島素分泌，而降糖藥二甲雙胍可通過激活AMPK活性抑制胰島素分泌。故得出一個推論性假設：AMPK的激活與胰島素的分泌可能呈負相關。故本實驗旨在探討小檗堿是否僅作為一種AMPK激活劑來調節NIT-1胰島細胞胰島素的分泌作用，以期能進一步研究小檗堿如何通過調節胰島細胞胰島素分泌來降血糖的作用機制。

實驗發現，隨著小檗堿濃度的增加，對NIT-1細胞生長抑制作用逐漸增強，并且在100 μmol/L時對NIT-1細胞出現明顯抑制作用。分別用葡萄糖和軟脂酸誘導NIT-1細胞成為高糖和高脂胰島β細胞模型后，小檗堿在濃度為30 μmol/L時即有明顯毒性。NIT-1細胞與正常胰島β細胞功能相似，可作為分析胰島分泌功能的一種理想的細胞模型[20]。本實驗結果表明，在正常NIT-1胰島細胞中，小檗堿可以降低基礎分泌量、糖刺激分泌量及軟脂酸刺激的胰島素分泌量，且隨著小檗堿濃度的增加，其對NIT-1細胞胰島素分泌的抑制作用加強。分別用葡萄糖和軟脂酸誘導NIT-1細胞成為高糖和高脂胰島β細胞模型后，分別用小檗堿進行短時相干預（1 h）和長時相干預（24 h），結果表明，在短時相干預中小檗堿可以抑制正常對照組及模型組的糖刺激胰島素分泌；而小檗堿干預24 h后顯示小檗堿一定程度促進模型組的胰島素分泌包括基礎分泌量和糖刺激分泌量。

綜上所述，在正常組NIT-1細胞中，小檗堿可以抑制基礎分泌量、糖刺激分泌量和軟脂酸刺激胰島素分泌量，且隨著濃度的增加抑制作用增強，提示小檗堿可能通過激活AMPK活性，降低胰島素分泌的作用從而保護胰島細胞功能。小檗堿對高糖、高脂誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的急相作用（1 h），表明小檗堿可以抑制高糖、高脂模型NIT-1細胞的糖刺激胰島分泌量，而小檗堿對高糖、高脂誘導的NIT-1細胞胰島素分泌的持續作用（24 h），則表明一定程度上小檗堿又可以促進高糖、高脂模型NIT-1細胞的胰島素分泌包括基礎和糖刺激胰島素分泌量。小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌的急相和持續作用分別表現為抑制和促進作用，提示小檗堿對胰島素分泌的調節可能具有非常復雜的機制，不僅有可能作為胰島素增敏劑來通過抑制胰島素分泌，改善胰島素抵抗，保護胰島β細胞，減緩病情的進展；而且有可能在長期用藥過程中作為溫和的胰島素促泌劑，通過保護胰島β細胞、促進胰島β細胞分泌胰島素來調節糖代謝，緩解臨床癥狀。綜上使得小檗堿在2型糖尿病的臨床治療中存在廣闊的應用前景。而且小檗堿可能并不僅僅作為一種AMPK激活劑來調節胰島素分泌的機制，其調節胰島素分泌機制的同時，也可能與cAMP及鈣離子通道等其他途徑存在著一定的聯系，還需要我們進一步研究和探討。

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（本文編輯 李 杰）

Effect of Berberine on Insulin Secretion in NIT-1 Cells

HU Yayun1,DONG Hui2
(1.The First Hospital of Wuhan,Wuhan,Hubei 430000,China；2.Institute of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine of Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

ObjectiveTo investigate the effect of berberine on insulin secretion of NIT-1 cells and the possible molecular mechanism.MethodsThe proper concentrations of berberine,insulin secretion level of NIT-1 cells,protein expression of AMP-activated protein kinase (AMPK)were detected by MTT,radioimmunoassay,and Western blotting.ResultsIn ordinary culture medium and in high glucose contained cultured medium,berberine significantly inhibited the proliferation of NIT-1 cells at the concentration of 100 μmol/L (P＜0.05).However,berberine significantly inhibited the proliferation of NIT-1 cells in high fat cultured medium.Berberine,at the concentration of 10 μmol/L,acutely (at 1 hour incubation)decreased but chronically (at 24 hours incubation)increased insulin secretion from NIT-1 cells in high glucose and palmitic acid contained culture medium (P＜0.01,P＜0.05).Berberine could promote the expression of AMPK protein in NIT-1 cells induced by high glucose and high fat.ConclusionBerberine not only acts as a AMPK activator to regulate insulin secretion,but also may affect insulin secretion through other pathways.

berberine;NIT-1 cells;insulin

R285

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.07.009

2015-12-10

國家自然科學基金資助項目(81673757,30973896)。

胡亞耘，女，碩士，研究方向：內分泌及代謝方向，E-mail：407347509@qq.com。