桑葉蛋白的功能和提取研究進展

劉一靜 劉繼 張馳松 涂彩虹 鄭旗 樊雪飛 馮駿 張正周

摘要 桑葉中蛋白質的含量可以占到干基重量的15%～30%，是蛋白含量較高的植物。對桑葉蛋白的功能特性及制備工藝等進行了系統性的論述。通過分析蛋白質的功能特性、提取方法及發展現狀，為深入研究桑葉蛋白以及開發桑葉蛋白新產品提供借鑒。

關鍵詞 桑葉蛋白；提取；功能性

中圖分類號 S789.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0089-03

Research Progress on the Function and Extraction of Mulberry Leaf Protein

LIU Yi-jing， LIU Ji， ZHANG Chi-song et al （Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Chengdu， Sichuan 611100）

Abstract The protein concentration of mulberry leaves ranges from 15% to 30%， which is quite high in plants. This paper described the functional characteristics and the extracting process of the mulberry protein. Through analyzing the functional characteristics， the extracting process and research status of mulberry protein， the study will provide reference for further research and development of mulberry protein products.

Key words Mulberry leaf protein； Extraction； Functionality

桑主要生長于熱帶和亞熱帶，在我國分布均勻，且種植面廣。桑樹在生態治理方面，具有防風固土[1]、治理石漠化[2]、復墾礦區[3]、修復重金屬污染耕地[4]、修復鹽堿地[5]的作用。桑葉作為桑樹的主要產物，約占桑樹地上部分產量的64%[6]。除去每年向國外出口的桑葉，我國仍有大量的桑葉剩余，造成一定的浪費。根據《本草綱目》《本草經解》和《本草再新》的記載，桑葉不僅可作為家蠶飼料，也具備潤肺熱、鎮靜神經、止咳的功效，已于1992年被衛生部列為藥食兩用的品種[7]。

作為最早開發和研究桑葉保健食品的國家之一，目前日本保健品市場年需桑葉5萬t左右，其中大部分原料進口自我國及東南亞國家。在歐美市場桑葉加工品的銷售額逐年增長，相關保健品逐漸暢銷的同時，國內對桑葉的研究以及應用還處于萌芽狀態。因此，深入研究桑葉功能成分及提取方法，對我國桑葉及相關產業發展具有重要意義[8]。

目前我國桑葉的原料十分充足，成本低廉，應用潛力巨大。若能在利用桑樹進行環境治理的同時，充分開發桑葉的藥用、食用價值，將對桑資源廢物再利用和我國蛋白質資源結構的改善起到促進作用。筆者就目前桑葉蛋白的研究開發現狀進行綜述，希望能夠為桑葉蛋白的深度研究和高附加值產品的開發提供參考。

1 桑葉蛋白的營養價值及藥效特性

1.1 營養價值

桑葉中粗蛋白的含量為干基重量的25%左右[9]，比日常飲食中的奶粉、燕麥等的蛋白質含量要高。通過酸沉法提取濃縮后所得桑葉粉的蛋白質含量可達42%左右，與大豆中蛋白質含量相當[10]。桑葉蛋白中總氨基酸含量為361.1 mg/g，其中人體所必需的氨基酸較為齊全，占總氨基酸含量的34.7%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）值為0.531，接近聯合國糧農組織/世界衛生組織（FAO/WHO）標準規定的必需氨基酸含量（40%）和E/N值（0.6）。桑葉蛋白的氨基酸比值系數分（SRCAA）為69.71，高于黑麥草葉蛋白，與綠豆蛋白、紫花苜蓿葉蛋白相當，與豬肉（74）營養價值接近，是營養價值較高的葉蛋白[7]。

1.2 藥效特性

喬璐[11]的研究發現，通過堿性蛋白酶水解得到的桑葉蛋白水解肽，在體外具有很好的還原性，100 μg/mL的桑葉水解肽同40 μg/mL的維生素C的還原力相當，具有抗衰老的功效。桑葉中還含有豐富的γ-氨基丁酸（GABA），在干桑葉中的平均含量達到2.26 mg/g，高于大豆和茶葉中GABA的含量，占到氨基酸總量的1.12%[12]，而γ-氨基丁酸的前體物質谷氨酸則占到氨基酸含量的13.70%。γ-氨基丁酸具有極強的生理活性，是中樞神經系統的主要抑制性遞質，具有延長記憶、改善視覺功能、鎮定神經、抗焦慮、降血壓、改善肝功能的作用[13]。

2 桑葉蛋白的功能特性

桑葉蛋白的功能特性主要包括溶解性、持水性、乳化性及乳化穩定性和起泡性[9]。

2.1 pH對桑葉蛋白功能特性的影響

pH對桑葉蛋白的功能特性有明顯的影響。王芳等[14]的研究表明，桑葉蛋白在pH 5左右溶解度最小。這是由于此時的桑葉蛋白處于兼性離子狀態，凈電荷為零，蛋白質與水之間的作用力最弱，而蛋白質之間的作用力最強，最終導致桑葉蛋白的聚集和沉淀。同時桑葉蛋白的持水性[15]、乳化性及乳化穩定性[10]、起泡性[14]也最小。而遠離等電點時，蛋白溶解度升高，持水性、乳化性及穩定性、起泡性均增大。

2.2 溫度對桑葉蛋白功能特性的影響

溫度對桑葉蛋白的影響更為復雜一些，當溫度低于60 ℃時，桑葉蛋白的溶解度、持水性、乳化性及乳化穩定性隨溫度的升高而上升，這是因為一定范圍內的升溫可以促使蛋白質分子立體結構的伸展，從而增加蛋白質分子與水分子之間的相互作用力，達到增加溶解度的效果。但高于60 ℃以后，高溫會使桑葉蛋白變性，發生聚集與沉淀，因此溶解度、持水性、乳化性及乳化穩定性反而隨溫度的升高而降低[14]。4～80 ℃的溫度范圍內，桑葉蛋白的起泡性隨著溫度的升高而增大，這是因為適當的熱處理增加了蛋白質的膨脹度。

2.3 離子強度對桑葉蛋白功能特性的影響

當NaCl的濃度在0～1.0 mol/L的范圍內時，桑葉蛋白的溶解度、持水性、起泡性均與NaCl的濃度成正比。這是由于當鹽濃度升高時，蛋白質分子所帶凈電荷隨之增加，蛋白質溶解度增加。當NaCl的濃度在0.6～0.8 mol/L時，其乳化性和乳化穩定性最好。

2.4 蔗糖質量濃度對桑葉蛋白功能特性的影響

在50 g/L的范圍內，由于蔗糖的溶解降低了水分的活度，桑葉蛋白的溶解度和起泡性也隨之降低。但蔗糖能夠增加桑葉蛋白的乳化性和乳化穩定性。

3 桑葉蛋白提取方式的研究

目前國內外葉蛋白研究的重點是提取，以及如何使用最合適的方法和溶劑將蛋白質從其他雜質中分離出來。目前桑葉蛋白的提取方式主要有直接加熱法、酸堿沉淀法、有機溶劑法、鹽析法、乳酸發酵法、結晶和重結晶法以及泡沫分離技術，其中最常用的就是酸堿沉淀法。

在桑葉蛋白的實際應用中，不僅要考慮到桑葉蛋白的質量和提取效率，還要考慮成本和損耗等多方面因素。在具體生產過程中，應根據生產目的的不同選擇不同的提取方法。若作為飼料，需大量生產，對產品純度要求不高，考慮成本，可采用加熱法、酸堿沉淀法。考慮到節約能源、減少環境污染，則可使用乳酸發酵法。若是做生化用品，對蛋白質質量和純度要求較高，則可采用結晶和重結晶或泡沫分離技術。

3.1 直接加熱法

直接加熱法的優點是操作簡單、廉價，但蛋白質的產率和質量不高。加熱可使溶液中的葉蛋白迅速絮凝，同時也可鈍化溶液中的酶，從而使得蛋白質的酶解作用停止，減少蛋白質的損失。影響葉蛋白提取加熱溫度和時間的因素有葉蛋白中必需氨基酸及非必需氨基酸含量、含氮物質含量以及葉蛋白的消化速率。在一定條件下，溫度越高，葉蛋白得率越高，但當溫度過高時，也會使得蛋白質變性，從而導致葉蛋白的吸水性、乳化性和溶解性的降低。桑葉通過加熱沉淀法提取蛋白質的最適溫度為75 ℃[16-17]。

3.2 酸堿沉淀法

酸堿沉淀法具有操作方便、價格低廉的優勢，通常與加熱法結合成酸堿熱提法來提取蛋白質。通常在對材料進行浸提之后，用HCl來調整浸提液pH到4.0～4.5或者是用NH3·H2O或NaOH將浸提液的pH調整到8.0～8.5，使蛋白質絮凝[11，17]。孫崇臻等[10]的研究表明，桑葉蛋白酸法沉淀的最優pH為3.5，而酸熱沉淀法的最優組合為pH 3.0，加熱溫度75 ℃，提取時間15 min；同時柳斌等[18]的研究也得出相似的結論。

與此同時，通過輔助方法來提高蛋白得率和質量也是酸堿沉淀法提取蛋白質的一個研究熱點。相較于新鮮桑葉，從干桑葉中提取蛋白質更為困難，這是因為當細胞失水后，細胞壁縮小的同時，纖維化增強。屈紅森等[19]在采用酸沉淀法從干桑葉提取蛋白質的同時，利用枯草芽孢桿菌促進桑葉中蛋白質的釋放和提高桑葉蛋白的品質。朱天明等[20]的研究則通過纖維素酶來輔助桑葉蛋白的提取。

3.3 鹽析法

鹽析法簡單安全、價格低廉，但是通常制得的葉蛋白品綜合利用率和得率都不高[17]。鹽析法主要是利用浸提液中不同物質在鹽溶液中的沉淀濃度的不同來進行操作的。鹽析法需要在浸提液中加入大量的無機鹽，桑葉蛋白的溶液飽和濃度為65%[10]。王芳等[21]研究發現，以NaCl溶液為提取溶劑，再加上超聲波的輔助處理，大大提高了桑葉蛋白的得率。這是因為超聲波能夠在不破壞物質結構的條件下，有效地促進細胞壁的破損。

3.4 乳酸發酵法

發酵方法不需要加入強酸強堿，也不用加熱，可節約能源，但是發酵時間較長，并且容易造成營養物質的流失，如要進行規模化的生產則需要配置發酵設備，生產成本過大[22]。乳酸發酵法是指利用乳酸菌發酵產生的乳酸使得葉蛋白絮凝沉淀的方法[23]。乳酸發酵的酸效應使得葉蛋白在pH 3～4出現等電點凝聚。在瑞典、前蘇聯、西班牙等國家，通過這種方法來進行葉蛋白的工業化生產[24]。

3.5 結晶和重結晶法

結晶法是某種物質通過降溫或蒸發的方法在浸提液中以晶體狀析出的過程。初次結晶所獲得的晶體多含雜質，通過再次結晶這可以獲得較純的晶體，這一過程也被稱為重結晶。變性蛋白不能結晶，通過結晶或重結晶提取出的蛋白能保持天然的狀態。

3.6 泡沫分離技術

泡沫分離技術可用于分離低濃度的產品，且分辨率高，可獲得較高純度的富集液，具有運行成本低、操作方便的特質。泡沫分離技術是利用氣泡作為分離介質來濃集表面活性物質的分離技術，又被稱為泡沫吸附分離技術[25]，是根據被分離物質的表面活性的不同，采用無機鹽和有機溶劑等分離介質來進行分離[26]。由于蛋白質具有一定的表面活性，因此也可以利用泡沫分離技術來進行蛋白的分離[27]。在劉海彬等[28]的研究中，先用氫氧化鈉溶液作為提取劑，制得桑葉蛋白提取液，在分離溫度25 ℃、稀釋40倍、pH 5.0、離子強度0.18 mol/kg的條件下，桑葉蛋白液中的蛋白回收率為92.50%；冷凍干燥后，蛋白質的純度從蛋白提取液固形物中的34.38%提高到泡沫層固形物中的65.51%。

4 桑葉蛋白食品研究現狀及發展前景

綠葉是人類獲取蛋白質最有效、最廉價的途徑之一。綠葉中的蛋白質比植物莖桿部分要高50%～500%。我國植物綠葉資源豐富，目前全年的綠葉產量為20億～25億t，而利用率只有10%～30%。綠葉資源分布既遍布全國，又相對集中[29]。我國綠葉蛋白的研究工作起步比較晚，而國外已有80余年的將葉蛋白作為蛋白飼料的研究歷史。早在1972年法國就建立了葉蛋白的工業化生產廠[24]，而后，英國、丹麥、新西蘭等國也成立了規模較大的葉蛋白生產工廠。

目前我國關于桑葉蛋白的提取研究已經比較成熟，其中多為利用酸堿沉淀法提取桑葉蛋白，桑葉蛋白的得率在9%～17%[11，19]，而其中蛋白質含量在50%左右。雖然已有大量的關于桑葉蛋白提取的研究，但是這些研究還局限于實驗室階段，并沒有一套適合工廠擴大生產的提取工藝。

國外有研究表明，將桑葉蛋白和其他葉蛋白混合，代替傳統的飼料喂養懷孕的母羊，對孕期的母羊有積極良好的作用。在高蛋白飼料方面，預計到2020年我國每年蛋白質飼料的需求量為7 200萬t，屆時將有3 600萬t需要從國外進口[30]。開發高桑蛋白的飼料可以在有效利用桑葉資源的同時，緩解我國高蛋白飼料的短缺狀況[31-32]。

有研究表明，將苜蓿葉蛋白添加到面條或面包中，可以改善面條和面包的口感[33]。國內外也有大量的試驗證明，在日常飲食中添加葉蛋白能提高人的身體素質[34-35]。而目前很少有桑葉蛋白在食品方面的研究及應用。在未來的研究中，可以將桑葉蛋白在食品中的研究和應用作為發展方向，在增加食品蛋白質的同時，改善食品的加工特性。

除此之外，桑葉蛋白還可以應用到化妝品、洗滌等日用品中。水解后得到的桑葉蛋白水解肽具有較強還原能力，是天然的抗氧化劑[11]。在桑葉蛋白提取過程中還可進一步分離制得一系列的副產物，例如維生素E、葉綠素等。這些產物也可在食品及醫藥應用等方面得到更多的應用。由此可見，我國桑葉蛋白的開發前景非常廣闊。

參考文獻

[1] 陳敏剛，金佩華，魯興萌，等.蠶桑生態系統服務功能價值的初步評估[J].蠶業科學， 2005，31（3）：316-320.

[2] 賈洪亮，邱長玉.桑樹在生態治理方面的應用前景展望[J].廣西蠶業，2015，52（3）：57-60.

[3] 周連碧.我國礦區土地復墾與生態重建的研究與實踐[J].有色金屬工程， 2007，59（2）：90-94.

[4] 田智得，黃紅燕，韋偉，等.廣西桑樹開發利用的三大途徑[J].廣西蠶業，2014（2）：45-47.

[5] 柯裕州.桑樹抗鹽性研究及其在鹽堿地中的應用[D].北京：中國林業科學研究院，2008.

[6] 成根杰.山西桑樹資源利用現狀及發展模式探討[J].山西農業科學， 2010，38（10）：70-73.

[7] 王芳，喬璐，張慶慶，等.桑葉蛋白氨基酸組成分析及營養價值評價[J].食品科學， 2015，36（1）：225-228.

[8] 我國桑葉資源豐富和開發前景分析[R/OL].（2010-06-08）[2016-10-25]. http：//ccn.mofcom.gov.cn/spbg/show.php？id=10632.

[9] GUVEN I.Effect of species on nutritive value of mulberry leaves[J].Kafkas Universitesi Veteriner Fakuültesi Dergisi， 2012，18（5）：865-869.

[10] 孫崇臻，武文佳，閔甜，等.不同制備方法桑葉蛋白功能性質的比較[J].現代食品科技， 2015（12）：242-249.

[11] 喬璐.桑葉蛋白的提取與應用研究[D].杭州：浙江師范大學，2014：77.

[12] 邊偉.高含量GABA桑茶的制備及其品質研究[D].重慶：西南大學，2014：70.

[13] 楊昌軍，宛曉春，黃繼軫.γ-氨基丁酸茶（Gabaron Tea）的研究現狀[J].茶業通報，2004，26（1）：13-15.

[14] 王芳，劉華，董梅紅.桑葉蛋白的功能特性研究[J].食品科學，2010，31（11）：81-86.

[15] 徐志宏，魏振承，張雁，等.幾種蛋白質功能性質的比較研究[J].食品科學，2006，27（12）：249-252.

[16] 李道娥.加熱法提取葉蛋白的工藝研究[J].農業工程學報，1998，14（1）：238-242.

[17] 田麗萍，劉青廣，劉剛.苜蓿葉蛋白提取方法及開法前景[J].草業科學，2004，21（10）：37-40.

[18] 柳斌，席亞麗，穆峰海，等.不同處理條件對苜蓿葉蛋白凝聚效果的研究[J].草業科學，2010，27（1）：114-118.

[19] 屈紅森，游朵，吳瓊英，等.用發酵法制備桑葉蛋白的工藝優化和產品的體外消化率測定[J].蠶業科學，2012（5）：885-892.

[20] 朱天明，陳泠伶，楊瀟，等.纖維素酶輔助提取桑葉中葉蛋白的工藝[J].西華大學學報（自然科學版），2016，35（2）：77-81，109.

[21] 王芳，喬璐，張慶慶，等.超聲波輔助提取桑葉蛋白加工工藝[J].山西農業科學，2014，42（2）：174-177.

[22] D′ALVISE N，LESUEUR-LAMBERT C，FERTIN B，et al.Hydrolysis and large scale ultrafiltration study of alfalfa protein concentrate enzymatic hydrolysate[J].Enzyme Microb Technol， 2000，27（3/4/5）：286-294.

[23] 葛旦之，羅翠蘭.發酵酸法提取水花生葉蛋白的工藝技術研究[J].中國飼料， 1995（15）：12-14.

[24] 郭佩玉，葛旦之，趙之陽，等.飼用葉蛋白工業生產技術考察團赴意大利、俄羅斯考察報告[J].中國飼料， 1995（21）：38-41.

[25] CHARM S E.Chapter 9：Foam separation of enzymesand other proteins[M]//Adsorptive Bubble Separation Techniques.[s.l.]：Elsevier Inc.，1972：157-174.

[26] 譚相偉，吳兆亮，賈永生，等.泡沫分離技術在蛋白質多元體系分離中的應用[J].化工進展，2005，24（5）：510-513.

[27] 董紅星，裴健，劉劍.泡沫分離法的現狀與研究進展[J].化工時刊， 2004，18（5）：20-22.

[28] 劉海彬，張煒，陳元濤，等.響應面法優化泡沫分離桑葉蛋白工藝[J].食品科學， 2015，36（8）：97-102.

[29] 劉曉庚.葉蛋白的資源、特性、加工和綜合利用（一）[J].林產化工通訊， 1998（4）：39-43.

[30] 楊春波.苜蓿葉蛋白的提取與應用研究[D].無錫：江南大學，2007：48.

[31] PATRA A K， SHARMA K， DUTTA N，et al. Effects of partial replacement of dietary protein by a leaf meal mixture on nutrient utilization by goats in pre-and late gestation[J].Small ruminant research， 2006，63（1/2）：66-74.

[32] LIU J X，YAO J，YAN B，et al.Effects of mulberry leaves to replace rapeseed meal on performance of sheep feeding on ammoniated rice straw diet[J].Small ruminant research，2001，39（2）：131-136.

[33] 謝正軍.苜蓿葉蛋白和酶法制備抗氧化肽的研究[D].無錫：江南大學，2009：120.

[34] 邱業先，羅澤民.植物葉蛋白的研究及其工業化生產[J].世界農業，1998（12）：20-22.

[35] FERNANDEZ S S， PADILLA A P， MUCCIARELLI S.Protein extraction from Atriplex lampa leaves：Potential use as forage for animals used for human diets[J].Plant foods human nutrition， 1999，54（3）：251-259.