冬蟲夏草大米培養基培養條件的正交試驗篩選

謝昕+陳春+葉素丹

摘要 冬蟲夏草是一種被人們普遍接受的藥用真菌。由于其生長緩慢，培養條件苛刻，故難以大規模人工培養應用。本文以實驗室分離得到的蟲草菌株Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041為研究對象，通過正交試驗設計對影響蟲草菌株在大米培養基上生長的光照、溫度和菌液接種量這3個因素進行9 d的觀察，每3 d記錄菌體的增重量，以確定大米培養基培育蟲草的最佳生長條件，并測量其甘露醇含量。結果表明，3個影響因子光照、溫度和菌液接種量的重要性在生長初期（前3 d）依次為光照>溫度>菌液接種量；在生長中期（3～6 d）為溫度>光照>菌液接種量；在生長后期（6～9 d）為光照>溫度>菌液接種量。培養蟲草菌的最適條件為光照24 h、培養溫度25 ℃、1∶1（mL∶g）的菌米接種體積重量比。而米基培養的M2016041菌株菌絲中蟲草酸含量為（8.42±0.45） mg/g。本試驗能夠為人工模擬自然條件下蟲草的大規模培養提供一種有效的技術方法。

關鍵詞 冬蟲夏草；大米培養基；甘露醇；正交設計

中圖分類號 S567.3+5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）10-0063-03

Abstract Ophiocordyceps sinensis is one kind of widely accepted medical fungus.However，it is hard to cultivate artificially for the large scale application because of its slow growth rate and fastidious cultivation conditions.In this study，taking Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041 reserved in laboratory as test material to study its biological characteristics and the optimal cultivation conditions on rice medium.By means of orthogonal design of experiments on the effects of Ophiocordyceps strain on the rice medium，three factors including light，temperature and inoculum size were observed for 9 days，weight recording every 3 days，in order to tetermine the optimum growth condition.Meanwhile the content of mannitol in the hyphae was determined.It suggested that in the initial growth stage （before 3 days），the range values of three factors were 0.098，0.057 and 0.022，and the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.In the middle growth stage （3-6 days），the ranks of importance was following：temperature> light > inoculum size.In the late growth stage （6-9 days），the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.The optimum conditions for culturing cordyceps sinensis were light time 24 h，culture temperature 25 ℃，and volume weight ratio of bacteria and rice as 1∶1.Results were showed that the content of mannose in the hyphae was（8.42±0.45） mg/g.Conclusively，this study could provide an effective technical met-hod which could be artificially simulated under natural conditions for large-scale cultivation of Ophiocordyceps.

Key words Ophiocordyceps sinensis；rice culture medium；mannitol；orthogonal experimental design

目前，世界上已發現冬蟲夏草屬真菌400多種，其中我國記錄有60多種，主要分布在吉林、遼寧、陜西等地[1-2]，而冬蟲夏草就是特指以青藏高原為主產地、中國特有的冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）。冬蟲夏草屬于肉座菌目麥角菌科，是一種能夠感染喜馬拉雅蝙蝠蛾或蟲草蝙蝠蛾幼蟲的昆蟲病原真菌[2]。研究表明，冬蟲夏草在免疫調節、祛痰平喘、對肝腎損傷的保護、抗腫瘤、治療肝功能衰竭等方面具有明顯的效果[2-3]。

近20年來，國內的一些科研院所相繼開展了人工培養和深層發酵培養蟲草菌絲體的研究，但蟲草真菌保健品大部分停留在利用液體培養菌絲體階段[4-5]，在固體培養基上培養則報道不多。大米培養基是一種常見的蟲生真菌固體培養基，在美國和日本得到大量的使用[6-8]。但是現在還沒有辦法做到冬蟲夏草人工栽培的大規模生產，還存在許多技術上的問題，如冬蟲夏草菌生長緩慢，侵染率低且侵染的影響因素不明等。不解決這些問題就沒有辦法實現冬蟲夏草的大規模生產[6-7]。另外，由于冬蟲夏草是昆蟲寄生真菌，表現出高度的宿主特異性，不同地區的蟲草菌具有不同的生長特性因素[8]。因此，篩選蟲草菌最適的生長條件的培養技術對更好地利用這一寶貴資源至關重要。

本文擬通過浙江省生物計量與檢驗檢疫重點實驗室分離得到的蟲草菌株M2016041，以常用的大米培養基作為基礎培養基對3個影響培育的主要因素（溫度、光照和接種比）對蟲草菌株的產量和相關指標進行正交試驗，篩選出最適蟲草生長的條件，以期能夠為人工模擬自然條件下蟲草的大規模培養提供一種有效的技術方法。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及培養準備

從采自寧夏的冬蟲夏草蟲體上篩選獲得一株生長良好的蟲草菌株，經18S rRNA鑒定為Ophiocordyceps sinensis，命名為CCTCC M2016041，并已經送至中國典型培養物保藏中心保存。取冰箱中儲存的蟲草菌株適量接種到SDAY薩氏培養基（Difco）上，放在20 ℃黑暗條件下培養。將培養1周左右的菌落挑取接種到已高溫高壓滅菌SDB液體培養基（葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%）中，接種量為固體培養基內總菌種量的50%以上。放入恒溫震蕩搖床，以150 r/min、20 ℃條件培養7 d。

1.2 大米培養基的制作

稱取200 g大米放入燒杯中，加入足量的沸水，攪勻，浸泡30 min后沖洗4～5遍，用紗布徹底濾干后放入60 ℃烘箱中烘15～30 min[9]。取出后用錫箔封好放入高壓滅菌鍋，121 ℃溫度下滅菌15 min。將已滅菌的大米均勻分開后加入上述SDB培養液15 mL，并充分攪拌。再將大米均勻地鋪在9 cm培養皿中，每個培養基加10 g滅過菌的大米。

1.3 蟲草菌株M2016041的接種方法

取3支干燥潔凈的15 mL離心管，依次加入5、10、15 mL上述培養獲得的蟲草菌液，7 000 r/min離心3 min，去上清，加入10 mL無菌水混勻清洗，7 000 r/min離心5 min后再次去除上清，向沉淀菌體中加入13 mL 0.01% Tween80溶液，用槍頭輕輕混勻成懸濁狀態待噴霧用。取制作好的上述大米培養基，使噴霧器的噴頭與培養基表面呈90°角垂直噴灑，每個培養基噴灑1.5 mL，每種濃度處理9次重復。

1.4 蟲草菌株生長最優條件篩選

試驗設3個因素，為溫度、光照條件、蟲草菌的接種量。溫度設為20、25、30 ℃ 3個水平，光照條件分別為黑暗24 h、光照24 h、12 h光照12 h黑暗，菌液接種量分別為5、10、15 mL。正交設計方案如表1所示。試驗過程中設定接種后的1 d記為作D1，觀察分別在D3、D6和D9進行，將大米培養基培養物放入50 mL離心管中再加入25 mL無菌水，進行超聲后，8 000 r/min離心5 min后稱取菌體的重量。

1.5 甘露醇標準曲線的測定

稱取1 g的甘露醇于大燒杯中，量取1 L去離子水配制成1 mg/mL的甘露醇溶液，取6支試管分別編號為1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1 mg/mL的甘露醇溶液，再加入去離子水，使各試管中的甘露醇濃度分別為10、20、30、40、50、0 μg/mL。將配制的溶液分別取1 mL至新的試管，試管對應標記1～6。再向各試管中加入1 mL高碘酸鈉溶液，室溫放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash試劑，53 ℃水浴15 min。通過對甘露醇標準液的比色法得甘露醇含量的標準曲線。

1.6 蟲草甘露醇含量的測定

取培養完全的固體培養基上的蟲草菌置于干燥的無菌培養皿中，60 ℃的烘箱中過夜。稱取烘干后的蟲草菌0.5 g置于50 mL的離心管中超聲15 min，離心取上清，重復離心取上清置于5 mL的離心管中，加入一定量的去離子水定容至5 mL即濃度為0.1 g/mL，待用。取6支試管分別編號為1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0 mL的0.1 g/mL的蟲草菌液，再加入去離子水，使各試管中的蟲草液濃度分別為1、2、3、4、5、0 mg/mL。將配制得到的溶液分別取1 mL至新的試管，試管對應標記1～6。再向各試管中加入1 mL高碘酸鈉溶液，室溫放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash試劑，53 ℃水浴15 min。通過比色法測得蟲草菌樣品的OD值，根據標準曲線獲得相應的含量值，取其平均數。

2 結果與分析

2.1 最優條件的篩選

蟲草菌CCTCC M2016041在大米培養基培養前和固體培養期間的生長狀況如圖1所示。可以看出，接種后3 d部分大米表面有少許白色斑點產生，但多半大米表面沒有改變。菌種的覆蓋程度從高到低依次為25 ℃、10 mL菌接種量，30 ℃、15 mL菌接種量，20 ℃、5 mL菌接種量。另一個明顯的區別是 25 ℃條件下的米培養基中蟲草菌的厚度沒有30 ℃的大，但是30 ℃條件下蟲草菌的分布較不均勻，覆蓋厚的部分較少，其余部分沒有長，或者厚度沒有20 ℃條件下的蟲草菌覆蓋厚。接種后6 d，大米表面的米白色斑點部分已經連成片，覆蓋面積明顯變大，覆蓋部分呈現半透明狀。蟲草菌在20 ℃、15mL菌接種量的大米培養基的生長覆蓋厚度比其在25 ℃、5 mL菌接種量和30 ℃、10 mL菌接種量條件下要薄。從接種后9 d蟲草培養的狀況來看，所有的培養基中的大米表面幾乎覆蓋完全且厚度較均一。雖然25 ℃下和30 ℃下覆蓋厚度沒有明顯的差別，但20 ℃明顯較其他2組的菌要低。

由圖2可知，接種后3 d各組菌增長量差異最顯著，最能體現單個因素對蟲草菌生長的影響。其中處理5增長量最明顯，其菌體增重量為0.398 5 g，培養條件為25 ℃、10 mL菌接種量和24 h光照。其次為處理9和處理6，培養條件分別為30 ℃、5 mL菌接種量、12 h光照和30 ℃、10 mL菌接種量、24 h光照。由此可認為，適合蟲草菌生長的米培養基的溫度條件偏高，為25 ℃或25～30 ℃之間的一個溫度，而其光照條件明顯偏向光照時間較長的條件。至于菌接種量則沒有明顯的規律性。接種后6 d，除處理6明顯高于其他組外，處理1～5沒有明顯的區別，還有一個明顯的差別在于處理7～9，存在明顯的梯度，這3個處理的試驗控制的條件是光照時間均為12 h，溫度分別為20、25、30 ℃，菌接種量分別為10、15、5 mL。可以推測蟲草菌生長到第6天時，溫度對其生長有一定的影響，且在給定的溫度范圍內，菌的增重量隨溫度的升高而增長。接種后9 d由于所有處理的蟲草菌幾乎都生長完全，所以各組之間的菌增重量沒有明顯的差別。

由表2可知，接種后3 d極差分析表明，處理5與其余處理有明顯差異，處理5的培養條件為24 h光照、培養溫度 25 ℃、10 mL的菌接種量。接種后6 d，菌增重量以處理5、6、9的數據顯著性差異最多。接種后9 d蟲草菌幾乎覆蓋大米表面，各處理所得的菌增重量都沒有顯著性差異。

由上述可得，培養蟲草菌的最適條件為光照24 h、培養溫度25 ℃、菌接種量10 mL。在生長初期（D3前），3個影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.098、0.057、0.022，重要性依次為光照>溫度>菌液接種量。在生長中期（D3～D6），3個影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.074、0.101、0.069，重要性依次為溫度>光照>菌液接種量。在生長后期（D6～D9），3個影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.052、0.059、0.040，重要性依次為光照>溫度>菌液接種量。在生長初期和中期，各處理間光照和溫度因子的差異顯著（P<0.05），而菌液接種量在整個過程中均不顯著。

2.2 蟲草酸的測定

由圖3可知，通過甘露醇標準液的配制，得出甘露醇含量的標準曲線，并且得出其回歸方程y=66.367x+0.064 1（R2=0.998 2）。再將試驗得到的蟲草菌的樣品液中測得的OD值帶入回歸方程中，可得到5個值，取其平均數得到甘露醇在冬蟲夏草中的的含量為（8.42±0.45）mg/g。

3 結論與討論

近年來，中國一些地方已經能夠進行蟲草的大規模栽培。蛹蟲草可以寄生在動物中如蠶或蠶蛹中來培養，也可以用大米為培養基來栽培，而大米及其添加物培養則是目前人工培育的主要方法[10-11]。本試驗通過蟲草菌在大米培養基上的生長情況，對影響其生長的因素進行了最優篩選，結果發現本菌種在大米培養基上的最適生長條件為光照24 h、培養溫度 25 ℃、菌接種量10 mL（菌米接種體積、重量比為1∶1，mL∶g）。

昆蟲的生長發育遵循有效積溫法則，在有效溫度范圍內，溫度愈高，發育速率愈快，而發育所需天數就愈少；反之，發育所需天數就愈多[1]。提取得到的菌種依舊保留著該屬性，適當的高溫有助于菌種的生長。關于菌接種量對蟲草的生長沒有明顯的促進作用，可能是因為菌種經過離心和0.01%吐溫溶液溶解后，濃度高的菌體和濃度低的菌體與大米培養基的接觸面積是一樣的，只能靠與培養基接觸的部分菌絲體吸收營養，覆蓋在菌體上的蟲草菌不能直接吸收營養，因而生長繁殖較慢[6]。而濃度低的蟲草菌液在保證覆蓋米表面的前提下重復的覆蓋率沒有濃度高的多，所以生長速率沒有因濃度的不同而有明顯的變化。

另外，本文只是利用大米培養基作為基礎培養基來篩選冬蟲夏草人工培養的相關條件，以后可以添加其他研究報道的培養基質，如白高粱[12]，或者培養添加物，如植物油[12]等來進一步試驗，以提高蟲草菌絲的產量和生物活性物質含量。

冬蟲夏草的生長地特別是西藏、青海一帶，由于每年大量的采挖，對當地的土質環境有相當大的破壞，甚至在雨季容易導致山體滑坡，最終造成水土流失。尋找一種可以模擬替代冬蟲夏草生長環境的培養基技術對更好地利用這一寶貴資源至關重要。本研究開發的成熟模擬培養技術為冬蟲夏草保健品的開發提供一條新的技術路徑，而且可以套用到其他藥用真菌的模擬培養，使得蟲生藥用真菌產業多樣化和“平民化”，對替代日趨減少的冬蟲夏草野生資源和保護西部地區逐步惡化的生態環境具有顯著的社會效益和經濟效益。

4 參考文獻

[1] 張古忍，余俊鋒，吳光國，等.冬蟲夏草發生的影響因子[J].生態學報，2011，31（14）：4117-4125.

[2] 魏玲，趙應華，郭遂.冬蟲夏草活性成分的含量研究概況[J].華西藥學雜志，2003，18（5）：359-360.

[3] 張虹，吳雪美.高效液相色譜-質譜聯用法分析冬蟲夏草及其功能食品中的活性成分[J].中國食品學報，2007，7（5）：113-121.

[4] 朱雅紅，桂仲爭.蛹蟲草液體菌種通氣發酵培養及其營養成分分析[J].食品與生物技術學報，2009，28（5）：699-704.

[5] 李玉玲.不同因子對冬蟲夏草真菌產生分生孢子的研究[J].食用菌，2002，24（5）：8.

[6] 潘少茜，陳衛東，吳娛明，等.不同處理對蟲草菌生長效果的影響[J].廣東蠶業，2006，40（3）：28-31.

[7] 溫志新，孫永欣，李學軍，等.大米培養基添加不同營養成分培養蛹蟲草試驗[J].食用菌，2011，33（2）：29.

[8] 謝翎，陳紅梅，樊美珍，等.利用大米固態發酵生產球孢白僵菌的工藝優化[J].食品與發酵工業，2007，33（10）：85-88.

[9] 葉素丹，顧菲丹，陳春，等.串聯式生防真菌產孢箱的發酵工藝優化[J].食品與發酵工業，2013，39（6）：70-75.

[10] 鐘運俊，韋會平，陳斌.蛹蟲草中蟲草素的研究進展[J].中國實用醫藥，2008，3（36）：231-232.

[11] 李軍，陳廣生，方清茂，等.人工培養蛹蟲草與冬蟲夏草的比較研究[J].成都中醫藥大學學報，2010，33（3）：82-84.

[12] 梁宗琦，韓燕峰，梁建東.冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis研究中幾個值得關注的問題[J].微生物學通報，2010，37（11）：1692-1697.