胞核內高表達M—CSF對HeLa細胞生長增殖的影響

李旎　詹向陽　陳艷華

[摘要] 目的 分析人宮頸癌HeLa細胞核內M-CSF增高對化療藥物的影響。 方法 體外培養HeLa細胞、HeLa-M細胞以及轉染M-CSF空載體HeLa-C細胞。分別使用紫杉醇和順鉑（濃度分別為0.3、3、30 μg/mL）作用48 h，采用MTT方法比較細胞的相對活性，Westen blot分析轉染M-CSF對抗凋亡分子Bcl-2表達的影響。 結果 當兩種化療藥物的濃度為3、30 μg/mL時，與HeLa-C細胞和HeLa細胞相比，HeLa-M細胞活性明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；當濃度為0.3 μg/mL時三種細胞活性無明顯差異。Westen blot結果顯示，轉染M-CSF后能夠使細胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯升高。 結論 人宮頸癌HeLa細胞核中的M-CSF增高可以使細胞的藥抗性提高，從而抑制HeLa細胞的凋亡。

[關鍵詞] 人宮頸癌；HeLa細胞核；M-CSF；化療藥物

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）16-0030-03

[Abstract] Objective To analyze the effect of elevated M-CSF in nuclei on the chemotherapeutic drugs of human cervical cancer HeLa cells. Methods HeLa cells， HeLa-M cells and HeLa-C transfected with M-CSF empty vector were cultured in vitro. The paclitaxel and cisplatin（concentrations were 0.3， 3， 30 μg/mL） were used for 48 h， respectively. The relative viability of the cells was compared by MTT method. The effect of transfection with M-CSF on the expression of Bcl-2 was detected by Western blot analysis. The effect of paclitaxel and cisplatin （concentration 0.3， 3， 30 μg/mL） on the expression of anti-apoptotic molecule Bcl-2 was detected by MTT method. Results The viability of HeLa-M cells was significantly higher than that of HeLa-C cells and HeLa cells when the concentration of the two chemotherapeutic drugs was 3， 30 μg/mL， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference in cell viability between the three kinds of cells when the concentration was 0.3 μg/mL. The results of Western blot showed that the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly increased after transfection with M-CSF. Conclusion The increase of M-CSF in the nucleus of human cervical cancer HeLa cells can improve the drug resistance of the cells and inhibit the apoptosis of HeLa cells.

[Key words] Human cervical cancer； HeLa nucleus； M-CSF； Chemotherapy drugs

M-CSF即巨噬細胞集落刺激因子，簡稱集落刺激因子[1]，主要是由鏈間二硫鍵所形成的同源二聚體糖蛋白，其與CSF-1R相互作用會使受體發生二聚化反應，隨后可以與細胞內的多條信號通路發生相應的作用，比如JAK/STAT等，與不同細胞作用會產生不同的生物學效應[2-3]。2006年時相關學者以小鼠為例，使用抗M-CSF逆轉了種植在小鼠身上的MCF-7細胞，這說明在治療乳腺癌中，抗M-CSF是一種潛在的治療方法[4]。對婦女而言，宮頸癌是第二種常見的惡性腫瘤疾病，臨床上的常見藥物為順鉑類藥物，但是容易產生耐藥性[5-6]。因此，對人宮頸癌HeLa細胞核內的M-CSF研究具有深遠的意義。本研究對其進行相應研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從北京醫科大學細胞庫中購入人宮頸癌HeLa細胞，轉染的HeLa-C細胞以及轉染M-CSF細胞等需要在前期通過實驗轉染得到。所使用的MTT從Sigama公司購買。順鉑從哈爾濱三聯制藥公司購入，紫杉醇為齊魯制藥公司生產。DMSO由美國Ameresco公司生產，低溫高速離心機從德國引入，生化培養箱為SANYO公司生產，其他試劑為我國國內生產。

1.2 方法

1.2.1 培養細胞 所用細胞分別在DEME培養基中進行培養，其中含有10%小牛血清，將其放置在常溫37℃環境下、5%濃度CO2培養箱中，實驗周期選擇細胞的對數生長期。當前臨床上治療宮頸癌的主要藥物為紫杉醇和順鉑，具體的濃度按照臨床常規劑量進行配制。分別取高10倍和低10倍濃度作為比較濃度。

1.2.2 分組方法 順鉑治療情況下的三種細胞為實驗組，紫杉醇不同濃度情況下的三種細胞變化情況為對照組。

1.2.3 MTT檢測方法 首先，需要配制溶液，將0.5 g的MTT溶于磷酸緩沖液培養基中，容量為100 mL，細菌的去除使用0.22 μm濾膜過濾，置4℃環境下避光保存，配制和保存時都需要使用鋁箔紙來避光。其次，檢測細胞成長方法，對完全培養基的細胞濃度進行調整，濃度為5×103個/mL，每孔接入96孔培養板，再分別加入順鉑和紫杉醇，每組3孔，持續48 h。再加入100 μL/孔的DMSO，振搖均勻之后使用EXL-800型酶標儀測定。

1.2.4 Western blot測定方法 在細胞生長到90%左右時，需要使用冰預冷的PBS清洗2次。1000 rpm，時間為5 min，去除上清，再加入細胞裂解液，劑量為70 μL，沉淀，置冰上30 min，在4℃的環境下進行離心，10 min后收集上清。最后加入蛋白上樣緩沖液，在100℃的環境下煮沸，時間持續5 min，在-20℃溫度中保存。

1.3 統計學方法

本次研究所選用的統計學軟件為SPSS 19.7，對研究中涉及的數據進行分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料用%表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度化療藥物對M-CSF活性影響比較

共進行3次實驗，取平均值。當藥物濃度在3 μg/mL時，HeLa-M細胞核與HeLa細胞和HeLa-C細胞相比，細胞活性差異顯著（P<0.05）；當藥物濃度在30 μg/mL時，HeLa-M細胞核與HeLa細胞和HeLa-C細胞相比，細胞活性差異顯著（P<0.05）；而藥物濃度在0.3 μg/mL，三種細胞活性無顯著差異（P>0.05）。見表1。

2.2 Westen blot方法檢測結果分析

結果顯示，與HeLa細胞和HeLa-C細胞相比，HeLa-M細胞的Bcl-2表達明顯偏高（HeLa、HeLa-C、HeLa-M灰度值分別為0.08±0.04、0.06±0.02、0.34±0.07）。而HeLa和HeLa-C細胞之間無明顯差異，見封三圖1。

3討論

宮頸癌和乳腺癌均是比較常見的婦科惡性腫瘤，對婦女的健康產生嚴重的威脅[7]。近幾年研究發現，在包含宮頸癌和乳腺癌在內的許多惡性腫瘤中巨噬細胞集落刺激因子水平會出現異常升高的現象，但是在其相應的良性腫瘤中卻不容易被發現或處于正常現象，提示在血清的循環中，M-CSF很可能會成為這些腫瘤的分子標記物，與這些惡性腫瘤的發生存在密切的關系[8-10]。M-CSF簡稱為集落刺激因子，主要是由細胞信號轉導網絡中多種細胞所產生的細胞因子，此種細胞因子具有特異性[11]。根據相關研究證實，巨噬細胞集落刺激因子可能在許多腫瘤如宮頸癌等發生中扮演著十分重要的角色[12]。

M-CSF所發揮的作用十分重要，不管是正常情況還是腫瘤發生時，根據相關研究數據顯示在不少惡性腫瘤中通常會出現M-CSF水平異常增高的現象，但是在良性腫瘤或者交界性腫瘤中卻很難檢測到[13]。近幾年的研究更是表明M-CSF與惡性腫瘤的預后有著密切聯系，有學者提出可以將M-CSF作為一些惡性腫瘤的標記物。在治療腫瘤的過程中不少化療藥物均是通過誘導凋亡對細胞殺傷而實現治療腫瘤的目的[14-15]。由于腫瘤耐藥的靶分子、細胞凋亡相關基因可以與多藥耐藥其他途徑一起介導多藥耐藥。

為了明確HeLa細胞核內M-CSF對化療藥物所產生的影響以及相關的作用機制，本研究結果發現，在治療劑量以及高于治療劑量的情況下，人宮頸癌HeLa細胞核內的M-CSF細胞與對照組細胞相比，對紫杉醇和順鉑的敏感性更低，對化療藥物的敏感性降低將會導致患者在臨床治療過程中出現耐藥。本次研究分別以不同的化療藥物濃度進行研究，發現藥物濃度在0.3 μg/mL時，各種細胞的活性最高，但細胞之間的活性無明顯差異。另外，HeLa-M細胞的Bcl-2活性更高，Bcl-2是移植細胞凋亡增加耐藥性的重要分子機制。細胞對于凋亡抑制作用的增強很可能與抗凋亡基因自身的變化密切相關，比如其出現過度表達或突變、缺乏等現象。與細胞凋亡相關的基因包含Bcl-2和Bcl-x1等。前者過度表達將會使腫瘤細胞凋亡得到有效抑制，對化療藥物殺傷腫瘤細胞的效果產生一定影響。Bcl-2家族是與細胞凋亡相關的基因家族，為同一個同源蛋白家族。當前越來越多的學者研究證實，Bcl-2可以使化療的耐受性得到提高，還可提高腫瘤惡變的潛力和復發率。

綜上所述，人宮頸癌HeLa細胞核中的M-CSF增高可以使細胞的藥抗性提高，對HeLa細胞的消亡起到抑制作用。

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（收稿日期：2017-04-09）