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HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量

2017-07-13 19:58:20蔣順進(jìn)鄭雪媚林凌
安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2017年12期

蔣順進(jìn) 鄭雪媚 林凌

摘 要:目的:采用HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量。方法:測(cè)定色譜條件為:色譜柱為C18,5μm,4.6mm× 250mm,流動(dòng)相為:稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL,用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3~2.5,加水稀釋至3000mL,再加乙腈846mL,搖勻,過(guò)濾,即得。檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。結(jié)論:硫酸黏菌素在0.2~0.6mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,多黏菌素E1:相關(guān)系數(shù)R=0.9995、多黏菌素E2:相關(guān)系數(shù)R=0.9998、多黏菌素E3:相關(guān)系數(shù)R=0.9999、多黏菌素EI-1:相關(guān)系數(shù)R=0.9992、多黏菌素EI-7MOA:相關(guān)系數(shù)R=0.9996;硫酸黏菌素的回收率為98.6%~101.6%;多黏菌素E1重復(fù)性RSD為0.2%、多黏菌素E2重復(fù)性RSD為0.2%、多黏菌素E3重復(fù)性RSD為0.8%、多黏菌素EI-1重復(fù)性RSD為0.6%、多黏菌素EI-7MOA重復(fù)性RSD為0.5%。結(jié)論:該方法線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞:硫酸黏菌素;HPLC;組分含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R521 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2017)12-0024-03

Abstract:Objective:To determine the colistin sulfate content by using the HPLC method.Methods:Determination of chromatographic condition:chromatographic column for C18,5μm,4.6mm×250mm,mobile phase:to get anhydrous sodium sulfate 13.38g diluted with purified water to 2700mL,adjusted the pH to 2.3~2.5 with dilute phosphoric acid,diluted with water to 3000mL,and then add acetonitrile 846mL,shake,filtering,is obtained.The detection wavelength was 215nm. Conclusion:colistin sulfate in 0.2~0.6mg/mL is in good linear relationship,and polymyxin E1:correlation coefficient R = 0.9995,polymyxin E2,correlation coefficient R=0.9998,polymyxin E3,correlation coefficient R=0.9999,polymyxin EI-1:the coefficient of R=0.9992,polymyxin EI-7MOA:correlation coefficient R=0.9996;colistin sulfate recovery rate is 98.6%~101.6%;polymyxin E1 RSD of repeatability was 0.2%,polymyxin E2 RSD of repeatability was 0.2%,polymyxin E3 RSD of repeatability was 0.8%,polymyxin E I-1 RSD of repeatability was 0.6%,polymyxin EI-7MOA repetitive RSD 0.5%.conclusion:it provides a basis for its quality control as its wide linear range,short analysis time,sample pretreatment is simple,accurate and reproducible.

Key words:Colistin sulfate;HPLC;Content determination

硫酸黏菌素又名克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等,系由多黏桿菌培養(yǎng)液中獲得的堿性鎖環(huán)狀多肽類(lèi)抗生素,是多黏菌素E1和E2的混合物。該產(chǎn)品為白色粉末,具有易溶于水、耐熱、消化道不易吸收、排泄迅速、毒性小、無(wú)毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥菌株等特性。其對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌作用,幾乎對(duì)所有革蘭氏陰性菌有效,對(duì)綠膿桿菌有顯著作用。

在雞、豬的集約化飼養(yǎng)中,由大腸桿菌或沙門(mén)氏桿菌引起的動(dòng)物疾病是一種常見(jiàn)病,感染面廣、危害大。為了減少致病菌抗性的產(chǎn)生,世界范圍內(nèi)對(duì)抗生素的使用均有嚴(yán)格規(guī)定,人畜共用同種抗生素的現(xiàn)象日趨減少,硫酸黏菌素作為專(zhuān)用的獸用抗生素,能有效地防止這些致病菌的生長(zhǎng)并提高飼料的轉(zhuǎn)化率,同時(shí)還具有高效、低毒,在動(dòng)物體內(nèi)殘留少的特點(diǎn),在發(fā)達(dá)國(guó)家已廣泛使用,產(chǎn)品供不應(yīng)求。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)該產(chǎn)品優(yōu)越性的認(rèn)識(shí),需求量也在不斷提高,國(guó)內(nèi)市場(chǎng)顯現(xiàn)出較大潛力。

本研究按照歐洲藥典8.0要求[1],根據(jù)硫酸黏菌素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),建立了測(cè)定硫酸黏菌素組分含量的HPLC法。該方法具有線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),為硫酸黏菌素的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 日本島津SPD-20A液相色譜儀;柱溫箱CTO-20AC;超純水儀UPR-5T;超聲波清洗器KQ-500DE;天平METTLER MS105DU;硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源:Council of Europe;水為超純水,乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相:稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL,用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3~2.5,加水稀釋至3000mL,再加乙腈846mL,搖勻,過(guò)濾,即得。色譜柱:菲羅門(mén) C18 5u 4.6×250mm,檢測(cè)波長(zhǎng):215nm,流速:1.0mL/min,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:20μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制 稀釋液:20%乙腈水。對(duì)照儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取對(duì)照品230mg(實(shí)際稱(chēng)量重量:230.51mg,對(duì)照品含量87.2%),以稀釋液溶解并稀釋至50mL,制成約4mg/mL的對(duì)照儲(chǔ)備液。取上述對(duì)照儲(chǔ)備液10.0mL到100mL容量瓶中,加稀釋液定容,制成約0.4mg/mL的對(duì)照液。

1.4 樣品溶液的配制 精密稱(chēng)取50mg試樣到100mL容量瓶中,加稀釋液適量溶解,定容,過(guò)濾即得。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述0.4mg/mL的對(duì)照溶液20μL分別按本次試驗(yàn)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子(具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1)。

1.6 線(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取上述照品儲(chǔ)備溶液分別稀釋成0.2mg/mL、0.32mg/mL、0.4mg/mL、0.48mg/mL、0.6mg/mL的系列對(duì)照品溶液,按1.2色譜條件測(cè)定,以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸,多黏菌素E1:Y=3E-07X(R=0.9995)、多黏菌素E2:Y=4E-07X(R=0.9998)、多黏菌素E3:Y=3E-06X(R=0.9999)、多黏菌素EI-1:Y=3E-05X(R=0.9992)、多黏菌素EI-7MOA:Y=2E-05X(R=0.9996)說(shuō)明硫酸黏菌素在0.2~0.6mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(具體見(jiàn)圖1~圖5)。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,按1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定,進(jìn)樣6次,得多黏菌素E1面積的RSD為0.2%、多黏菌素E2面積RSD為0.2%、多黏菌素E3面積RSD為0.8%、多黏菌素EI-1面積RSD為0.6%、多黏菌素EI-7MOA面積RSD為0.5%,表明樣品重復(fù)性良好。具體見(jiàn)表2。

1.8 回收率試驗(yàn) 精密取已知含量的同一批樣品(約25mg(共9份)置于100mL容量瓶中,分別加入上述1.3.2項(xiàng)下對(duì)照儲(chǔ)備液3mL、5mL、7mL,按上述1.4項(xiàng)要求處理,進(jìn)樣測(cè)定,樣品硫酸黏菌素的回收率為100.0%,具體見(jiàn)表3。

2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量的方法,測(cè)定色譜條件為:色譜柱為菲羅門(mén)C18 5u4.6*250mm,流動(dòng)相為稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL,用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3~2.5,加水稀釋至3000mL,再加乙腈846mL,搖勻,過(guò)濾,即得。流速為1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm,在0.2~0.6mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。該方法具有線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

(責(zé)編:張宏民)

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