HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量

蔣順進(jìn)　鄭雪媚　林凌

摘 要：目的：采用HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量。方法：測(cè)定色譜條件為：色譜柱為C18，5μm，4.6mm× 250mm，流動(dòng)相為：稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3～2.5，加水稀釋至3000mL，再加乙腈846mL，搖勻，過(guò)濾，即得。檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。結(jié)論：硫酸黏菌素在0.2～0.6mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，多黏菌素E1：相關(guān)系數(shù)R=0.9995、多黏菌素E2：相關(guān)系數(shù)R=0.9998、多黏菌素E3：相關(guān)系數(shù)R=0.9999、多黏菌素EI-1：相關(guān)系數(shù)R=0.9992、多黏菌素EI-7MOA：相關(guān)系數(shù)R=0.9996；硫酸黏菌素的回收率為98.6%～101.6%；多黏菌素E1重復(fù)性RSD為0.2%、多黏菌素E2重復(fù)性RSD為0.2%、多黏菌素E3重復(fù)性RSD為0.8%、多黏菌素EI-1重復(fù)性RSD為0.6%、多黏菌素EI-7MOA重復(fù)性RSD為0.5%。結(jié)論：該方法線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：硫酸黏菌素；HPLC；組分含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R521 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）12-0024-03

Abstract：Objective：To determine the colistin sulfate content by using the HPLC method.Methods：Determination of chromatographic condition：chromatographic column for C18，5μm，4.6mm×250mm，mobile phase：to get anhydrous sodium sulfate 13.38g diluted with purified water to 2700mL，adjusted the pH to 2.3～2.5 with dilute phosphoric acid，diluted with water to 3000mL，and then add acetonitrile 846mL，shake，filtering，is obtained.The detection wavelength was 215nm. Conclusion：colistin sulfate in 0.2～0.6mg/mL is in good linear relationship，and polymyxin E1：correlation coefficient R = 0.9995，polymyxin E2，correlation coefficient R=0.9998，polymyxin E3，correlation coefficient R=0.9999，polymyxin EI-1：the coefficient of R=0.9992，polymyxin EI-7MOA：correlation coefficient R=0.9996；colistin sulfate recovery rate is 98.6%～101.6%；polymyxin E1 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E2 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E3 RSD of repeatability was 0.8%，polymyxin E I-1 RSD of repeatability was 0.6%，polymyxin EI-7MOA repetitive RSD 0.5%.conclusion：it provides a basis for its quality control as its wide linear range，short analysis time，sample pretreatment is simple，accurate and reproducible.

Key words：Colistin sulfate；HPLC；Content determination

硫酸黏菌素又名克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，系由多黏桿菌培養(yǎng)液中獲得的堿性鎖環(huán)狀多肽類(lèi)抗生素，是多黏菌素E1和E2的混合物。該產(chǎn)品為白色粉末，具有易溶于水、耐熱、消化道不易吸收、排泄迅速、毒性小、無(wú)毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥菌株等特性。其對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌作用，幾乎對(duì)所有革蘭氏陰性菌有效，對(duì)綠膿桿菌有顯著作用。

在雞、豬的集約化飼養(yǎng)中，由大腸桿菌或沙門(mén)氏桿菌引起的動(dòng)物疾病是一種常見(jiàn)病，感染面廣、危害大。為了減少致病菌抗性的產(chǎn)生，世界范圍內(nèi)對(duì)抗生素的使用均有嚴(yán)格規(guī)定，人畜共用同種抗生素的現(xiàn)象日趨減少，硫酸黏菌素作為專(zhuān)用的獸用抗生素，能有效地防止這些致病菌的生長(zhǎng)并提高飼料的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)還具有高效、低毒，在動(dòng)物體內(nèi)殘留少的特點(diǎn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家已廣泛使用，產(chǎn)品供不應(yīng)求。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)該產(chǎn)品優(yōu)越性的認(rèn)識(shí)，需求量也在不斷提高，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)顯現(xiàn)出較大潛力。

本研究按照歐洲藥典8.0要求[1]，根據(jù)硫酸黏菌素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立了測(cè)定硫酸黏菌素組分含量的HPLC法。該方法具有線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為硫酸黏菌素的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 日本島津SPD-20A液相色譜儀；柱溫箱CTO-20AC；超純水儀UPR-5T；超聲波清洗器KQ-500DE；天平METTLER MS105DU；硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源：Council of Europe；水為超純水，乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相：稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3～2.5，加水稀釋至3000mL，再加乙腈846mL，搖勻，過(guò)濾，即得。色譜柱：菲羅門(mén) C18 5u 4.6×250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制 稀釋液：20%乙腈水。對(duì)照儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取對(duì)照品230mg（實(shí)際稱(chēng)量重量：230.51mg，對(duì)照品含量87.2%），以稀釋液溶解并稀釋至50mL，制成約4mg/mL的對(duì)照儲(chǔ)備液。取上述對(duì)照儲(chǔ)備液10.0mL到100mL容量瓶中，加稀釋液定容，制成約0.4mg/mL的對(duì)照液。

1.4 樣品溶液的配制 精密稱(chēng)取50mg試樣到100mL容量瓶中，加稀釋液適量溶解，定容，過(guò)濾即得。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述0.4mg/mL的對(duì)照溶液20μL分別按本次試驗(yàn)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子（具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1）。

1.6 線(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取上述照品儲(chǔ)備溶液分別稀釋成0.2mg/mL、0.32mg/mL、0.4mg/mL、0.48mg/mL、0.6mg/mL的系列對(duì)照品溶液，按1.2色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸，多黏菌素E1：Y=3E-07X（R=0.9995）、多黏菌素E2：Y=4E-07X（R=0.9998）、多黏菌素E3：Y=3E-06X（R=0.9999）、多黏菌素EI-1：Y=3E-05X（R=0.9992）、多黏菌素EI-7MOA：Y=2E-05X（R=0.9996）說(shuō)明硫酸黏菌素在0.2～0.6mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（具體見(jiàn)圖1～圖5）。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣6次，得多黏菌素E1面積的RSD為0.2%、多黏菌素E2面積RSD為0.2%、多黏菌素E3面積RSD為0.8%、多黏菌素EI-1面積RSD為0.6%、多黏菌素EI-7MOA面積RSD為0.5%，表明樣品重復(fù)性良好。具體見(jiàn)表2。

1.8 回收率試驗(yàn) 精密取已知含量的同一批樣品（約25mg（共9份）置于100mL容量瓶中，分別加入上述1.3.2項(xiàng)下對(duì)照儲(chǔ)備液3mL、5mL、7mL，按上述1.4項(xiàng)要求處理，進(jìn)樣測(cè)定，樣品硫酸黏菌素的回收率為100.0%，具體見(jiàn)表3。

2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素組分含量的方法，測(cè)定色譜條件為：色譜柱為菲羅門(mén)C18 5u4.6*250mm，流動(dòng)相為稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉13.38g用純化水稀釋至2700mL，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3～2.5，加水稀釋至3000mL，再加乙腈846mL，搖勻，過(guò)濾，即得。流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，在0.2～0.6mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。該方法具有線(xiàn)性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

（責(zé)編：張宏民）