摘 要:為了提高紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的能力,分別采用紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯對出發(fā)菌株(Monascus sp.)進(jìn)行誘變處理。結(jié)果表明:3種誘變劑對Monascus sp.的誘變效果有較大差異,其中紫外線誘變效果最好,硫酸二乙酯次之,亞硝酸最差。通過篩選,得到2株高產(chǎn)突變株,分別命名為:Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8,其產(chǎn)量分別為 0.239 mg/mL、0.223 mg/mL,比原始菌株分別提高了42.3%、32.7 %。遺傳穩(wěn)定試驗結(jié)果顯示,Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩(wěn)定,可應(yīng)用于生產(chǎn)。
關(guān)鍵詞:洛伐他汀;紅曲霉;誘變;紫外線;硫酸二乙酯;亞硝酸
中圖分類號 S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731(2017)12-0027-03
Abatract:In order to improve lovstatin yield of Monascus sp.,the starting strains were treated by treated by UV,HNO2 and DES respectively. The results showed that three kinds of Mutagens had different effects on Monascus sp.,UV had best mutagenesis effects,then was DES and HNO2 was the worst. Two high and stable yield mutants were obtained and named Monascus sp. UV-5 and Monascus sp.DE-8 respectively.The lovstatin yield of Monascus sp.UV-5,Monascus sp. DE-8 was 0.239mg/mL and 0.223 mg/mL,which increased 42.3% and 32.7% compared with the original strain.The consecutive culture of Monascus sp. UV-5,Monascus sp. DE-8 showed that genetic performance was stable and can be used in production.
Key words:Lovstatin;Monascus sp.;Mutagenesis;UV;DES;Nitrous acid
近年來,隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展,人民生活水平不斷提高。我國民眾的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變,過多地攝入高熱量、高脂質(zhì)的食物,導(dǎo)致高血脂、高血壓、冠心病等“富貴病”發(fā)病率顯著增加。目前,臨床上治療該類疾病的主要是他汀類藥物,最重要的是洛伐他汀。洛伐他汀(Lovastatin)是一類在臨床上應(yīng)用廣泛的降血脂、降膽固醇藥物,作為體內(nèi)羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的結(jié)構(gòu)類似物,能競爭性抑制HMG-CoA的代謝,減少機體內(nèi)膽固醇的生成,從而對高血壓和冠心病等疾病起到積極的防治作用[1-4]。當(dāng)前,洛伐他汀主要是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn),在微生物發(fā)酵中,優(yōu)良的菌種是獲得生產(chǎn)成功的關(guān)鍵[5]。誘變育種是獲得高產(chǎn)菌株的簡便有效的手段在微生物育種中被廣泛應(yīng)用。課題組采用多種誘變劑對洛伐他汀產(chǎn)生菌株紅曲霉進(jìn)行處理,以期獲得穩(wěn)定高產(chǎn)菌株,為進(jìn)一步開發(fā)功能性紅曲提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 菌株 紅曲霉(Monascus sp.),粗糙脈胞菌(Neurospora crassa),均購于中科院微生物所,保藏于本院院生物制藥國家級實訓(xùn)基地。
1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基及平板培養(yǎng)基:馬鈴薯蔗糖固體(PDA)培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯蔗糖液體(PD)培養(yǎng)基。
1.1.3 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,購于上海永葉生物科技有限公司。
1.1.4 主要儀器設(shè)備 HJ-1磁力攪拌器(江蘇醫(yī)療);CBV-1500A超凈工作臺(上海瑞仰);QYC.2102搖床(上海福瑪);HPS-250生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東明);高效液相色譜儀(美國戴安)。
1.2 實驗方法
1.2.1 紫外線(UV)誘變 在超凈工作臺上,用接種環(huán)取紅曲霉孢子2環(huán),用無菌水制成孢子懸液,將孢子懸液分成6份(各5mL),放在紫外誘變裝置中分別處理0s、30s、60s、90s、120s、150s。然后取誘變處理后的孢子懸液0.1mL分別涂布于6個固體平板上,倒置培養(yǎng)3d,計算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進(jìn)行管碟法試驗,以抑菌圈直徑為指標(biāo),初篩突變株。突變效果好的進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗,以洛伐他汀產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩,并評價誘變效果。
1.2.2 亞硝酸(HNO2)誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1,將孢子懸液分成6份(各5mL),分別加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L NaNO2溶液1mL,然后加入1mL pH4.4醋酸緩沖液,于32℃保溫處理20min,加入pH8.6的Na2HPO4溶液,調(diào)整pH為7,終止誘變作用。適當(dāng)稀釋后涂布于固體進(jìn)行實驗,計算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進(jìn)行管碟法試驗,以抑菌圈直徑為指標(biāo),初篩突變株。突變效果好的進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗,以洛伐他汀產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩,并評價誘變效果。
1.2.3 硫酸二乙酯(DES)誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1,將孢子懸液分成6份(各5mL),分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%(v/v)的DES溶液5mL誘變處理10min,立刻加10mL的25%硫代硫酸鈉溶液中止反應(yīng)。誘變后的孢子懸液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尯螅〕?.1mL孢子液涂布到分別固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行實驗,并計算致死率。并進(jìn)行管碟法初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,并評價誘變效果。
1.2.4 菌種篩選 采用管碟法[7]進(jìn)行初篩。利用粗糙脈胞菌對洛伐他汀敏感的原理,在粗糙脈孢菌孢子液的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行抑菌實驗,通過測量抑菌圈直徑D進(jìn)行初篩。
采用HPLC法進(jìn)行復(fù)篩。高效液相測定洛伐他汀的條件為[8]:色譜柱:XDB C18柱;檢測波長237nm,流動相:甲醇:水(體積比為70:30),柱溫26℃,體積流量1.0mL/min,進(jìn)樣量20μL。
1.2.5 突變株遺傳穩(wěn)定性研究 將篩選到的實變株進(jìn)行斜面?zhèn)鞔鷮嶒灒B續(xù)傳種5代,分別測定洛伐他汀的產(chǎn)量,考察菌株的遺傳穩(wěn)定性能。
2 結(jié)果與分析
2.1 三種誘變劑致線曲線與分析
由圖1、圖3可知,紅曲霉菌株對UV、DES均比較敏感,致死率與誘變劑劑量呈正相關(guān)。當(dāng)UV照射時間為120s 時,致死率為72.1%。DES濃度為4%時,致死率為74.6%。由圖2可知,在實驗劑量范圍內(nèi),紅曲霉對HNO2不敏感,致死率低且變化不明顯,因此,不宜選HNO2作為紅曲霉的誘變劑。
2.2 UV誘變結(jié)果 從篩選平板上挑取抑菌圈直徑D≥1.48cm的10株菌株孢子,置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min搖床上發(fā)酵7d,測洛伐他汀產(chǎn)量。所得結(jié)果見表1。
由表1可知,在所得到的10株突變株中,抑菌圈直徑比原始菌株均有不同程度的增加,但洛伐他汀的產(chǎn)量則有高有低,總的來看大部分菌株的產(chǎn)量是提高的,即發(fā)生了正向突變,如UV-5、UV-10;而有少部分菌株的產(chǎn)量不升反降,如:UV-6、UV-9。其中UV-5的產(chǎn)量最高,達(dá)到了0.239mg/mL,相對于出發(fā)菌株提高了42.3%。說明出發(fā)菌株(Monascus sp.)對紫外線敏感,采用紫外線單因素處理即可得到較理想的誘變效果。
2.3 HNO2誘變結(jié)果 經(jīng)亞硝酸誘變后,通過初篩選擇9株抑菌圈直徑D≥1.42cm的突變株,置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min搖床上發(fā)酵7d,測洛伐他汀產(chǎn)量。所得結(jié)果見表2。由表2可知,經(jīng)亞硝酸誘變后,紅曲霉對粗糙脈胞菌抑菌圈直徑及洛伐他汀產(chǎn)量變化幅度均較小。在所得的9株紅曲霉突變株中,抑菌圈變化范圍1.42~1.76cm之間,洛伐他汀產(chǎn)量最高是HN-4、HN-8菌株,均為0.184mg/mL,比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高不到10%,說明該紅曲霉對亞硝酸不大敏感,這與致線曲線分析是一致的。
2.4 DES誘變結(jié)果 經(jīng)硫酸二乙酯誘變后,通過初篩選擇10株抑菌圈直徑D≥1.52cm的突變株,置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160r/min搖床上發(fā)酵7d,測洛伐他汀產(chǎn)量。得到結(jié)果見表3。
表3結(jié)果表明,篩選所得到的10株突變株中,大部分菌株發(fā)生了正向突變,產(chǎn)量均有不同程度提高,其中洛伐他汀產(chǎn)量最高的菌株為DE-8,達(dá)到了0.223mg/mL,增幅為32.7%。說明該紅曲霉對DES較為敏感,應(yīng)用DES對其進(jìn)行誘變育種能得到較理想的效果。但從洛伐他汀產(chǎn)量的提高幅度來看,DES的誘變效果不如UV好。可能的原因是此兩種誘變劑的誘變機理不相同所造成的,UV能誘發(fā)DNA形成胸腺嘧啶二聚體,導(dǎo)致復(fù)制中發(fā)生錯配而引起突變;而DES能與DNA中堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng),使堿基結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致堿基配對的轉(zhuǎn)換或顛換,從而引起突變[9]。
2.5 UV-5、DE-8遺傳穩(wěn)定性研究 對UV-5、DE-8菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性能測定,在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行5次傳代實驗,以洛伐他汀產(chǎn)量為測試指標(biāo),所得結(jié)果如表4所示。從表4可以看出,該2菌株洛伐他汀產(chǎn)量均較穩(wěn)定,相對產(chǎn)量≥95%。表明它們的遺傳性能均穩(wěn)定,有一定的生產(chǎn)應(yīng)用價值。
3 結(jié)論
采用UV、DES、HNO2 3種誘變劑分別對紅曲霉進(jìn)行誘變,采用管碟法初篩結(jié)合HPLC法復(fù)篩的方法選育高產(chǎn)菌株。實驗結(jié)果表明:3種誘變劑對Monascus sp.的誘變效果有較大差異,其中紫外線誘變效果最好,硫酸二乙酯次之,亞硝酸最差。通過篩選得到2株高產(chǎn)突變株,分別命名為:Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8,產(chǎn)量分別為 0.239mg/mL、0.223mg/mL,比原始菌株分別提高了42.3%、 32.7 %。遺傳穩(wěn)定試驗顯示,Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩(wěn)定,可應(yīng)用于生產(chǎn)。因此誘變育種是微生物育種中一種簡便、有效的方法。但UV與DES對紅曲霉誘變是否有協(xié)同作用,需進(jìn)一步進(jìn)行研究。
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