冬凌草甲素誘導三陰乳腺癌MDA—MB—231細胞凋亡及對細胞內活性氧水平的影響

齊琦+張配+李其響+潘瓊+鄭海倫+趙素容

[摘要] 冬凌草甲素是從中藥冬凌草Rabdosia rubescens中分離得到的一種貝殼杉烯二萜類的天然有機化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性。該實驗觀察冬凌草甲素對三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響及其可能的作用機制。采用MTT法檢測冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用，PI單染、Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術分析冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞凋亡的影響，活性氧（ROS）試劑盒檢測細胞內ROS水平的變化，Western blot分析PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白的表達情況。結果表明，冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞具有明顯的凋亡誘導作用，顯著升高細胞內的ROS水平，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并促進caspase-3及其底物PARP的切割。提示，冬凌草甲素誘導MDA-MB-231細胞凋亡的作用可能與升高細胞內ROS水平、下調Bcl-2的表達以及激活caspase-3相關。

[關鍵詞] 乳腺癌； 冬凌草甲素； 細胞凋亡； 活性氧

[Abstract] Oridonin， which is an ent-kaurene diterpenoid isolated from traditional Chinese medicine Rabdosia rubescens， displays various bioactivities， including anti-inflammation， anti-bacteria and anti-tumor. This study aimed to investigate the effect of oridonin on apoptosis of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and its underlying mechanisms. The inhibitory effect of oridonin on proliferation of MDA-MB-231 cells was measured by MTT assay； Apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining and Annexin V-FITC/PI staining； Intracellular reactive oxygen species （ROS） level was determined by ROS detection kit， and expressions of PARP， Bcl-2， caspase-3 were analyzed by Western blot. The results showed that oridonin exhibited a significant effect in inducing apoptosis of MDA-MB-231 cells， enhancing intracellular ROS level， down-regulating expression of Bcl-2 protein， and promoting cleavage of caspase-3 and its substrate PARP. These results indicated that the apoptosis-inducing effect of oridonin on MDA-MB-231 cells might be correlated with increase of intracellular ROS level， down-regulation of Bcl-2 protein and activation of caspase-3.

[Key words] breast cancer； oridonin； apoptosis； reactive oxygen

乳腺癌是世界范圍內嚴重危害女性健康與生命的惡性腫瘤，其發病率呈逐年增長的趨勢。近年來盡管其治療取得了長足的進步，但乳腺癌在發展中國家的發病率依然快速增長[1]。目前，外科手術、放療和化療是乳腺癌最主要的治療手段。雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性表達的乳腺癌，為三陰性乳腺癌（TNBC），該亞型的乳腺癌占乳腺癌病例數的12%～24%[2]。TNBC具有惡性程度高、侵襲性強、預后差等特征，并對內分泌治療和抗HER2的靶向治療均不敏感[3-4]。因此，尋找新的作用機制的治療藥物對TNBC的治療具有重要意義。

冬凌草甲素是從中藥冬凌草Rabdosia rubescens中分離得到的一種貝殼杉烯二萜類的天然有機化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[5]。其中，抗腫瘤作用的研究受到了廣泛關注，研究發現，冬凌草甲素對肺癌、結腸癌、胰腺癌等顯示了良好的抗腫瘤效應[6-8]，且毒副作用較低，尚未見對骨髓、肝臟、腎臟、心臟等重要臟器有明顯損傷作用的報道。該化合物以其顯著的抗腫瘤活性及低毒副作用等優勢，顯示了作為新型抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物的應用前景[9-10]。但冬凌草甲素抗腫瘤作用的具體機制并不明確。近年來，有研究表明某些化療藥物或化合物可通過升高腫瘤細胞內活性氧（ROS）水平殺傷腫瘤細胞[11-12]。本實驗將從ROS出發，探討冬凌草甲素誘導三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海細胞庫。于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，5%CO₂細胞培養箱中常規培養。

1.2 試劑 DMEM培養液（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；冬凌草甲素（Merck公司），以二甲基亞砜（DMSO）溶解；MTT，PI（Sigma公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（索萊寶公司）；ROS探針DCFH-DA，0.25%胰蛋白酶（碧云天生物技術研究所）；PARP，Bcl-2抗體（Santa Cruz公司）；caspase-3抗體（Abcam公司）；β-actin，HRP標記的山羊抗兔IgG（博士德公司）。

1.3 細胞存活率測定 96孔細胞培養板中每孔接種6×10³個MDA-MB-231細胞，細胞貼壁后更換新的培養液，加入不同濃度（10，20，30，40，50 μmol·L^-1）冬凌草甲素處理細胞，同時設不加藥物的對照組（加入等體積的培養液及溶劑DMSO）和空白對照組，每組3個重復。藥物處理48 h后每孔加入15 μL MTT液繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，結晶充分溶解后用酶標儀測定570 nm處吸光度A。

細胞存活率=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞早期凋亡 6孔細胞培養板中每孔接種3×10⁵個細胞，細胞貼壁后換液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培養液，設置不加藥物的對照組，每個處理3個重復。藥物作用24 h后收集細胞，調整細胞密度為5×10⁵～1×10⁶個/mL，取1 mL細胞，1 000 r·min^-1離心10 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2次。將細胞重懸于500 μL結合緩沖液中，每個樣品中加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min，上機前5 min加入5 μL PI，混勻，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.5 PI染色法檢測總的細胞凋亡率 6孔細胞培養板中每孔接種3×10⁵個細胞，細胞貼壁后更換新的培養液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素處理細胞，設置不加藥物的對照組，每個處理3個重復。藥物處理48 h后胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，75%冷乙醇-20 ℃固定過夜。測試前用PBS洗滌2次，將細胞重懸于300 μL PI液中，室溫避光反應30 min，上流式細胞儀分析具有subG₀/G1期DNA含量的細胞比例。

1.6 細胞內ROS檢測 6孔細胞培養板中每孔接種3×10⁵個細胞，細胞貼壁后更換新的培養液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素處理細胞，設置不加藥物的對照組，每個處理3個重復。藥物作用5 h后收集細胞，加入含10 μmol·L^-1 DCFH-DA的無血清培養液，37 ℃避光孵育20 min，用無血清培養液洗滌細胞3次，以充分去掉未進入細胞內的DCFH-DA，上流式細胞儀檢測DCF的熒光強度。

1.7 Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達 接種細胞于6孔細胞培養板中，5×10⁵個/孔，培養24 h后換液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培養液，設置不加藥物的對照組。藥物處理24 h后胰酶消化收集細胞，PBS洗2次，每處理組細胞加入50 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白，以牛血清白蛋白為標準采用BCA法測定各處理組的蛋白濃度。每處理組取50 μg蛋白進行12% SDS-PAGE垂直電泳；蛋白采用濕法轉膜至PVDF膜；Western封閉液室溫封閉2～3 h；一抗室溫孵育1～3 h或4 ℃過夜；二抗室溫孵育1 h；ECL發光試劑盒顯影；Bio-Rad 凝膠成像儀曝光獲取圖像。

1.8 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行方差分析，組間差異比較采用LSD檢驗，當P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響 MTT實驗結果表明，與對照組相比，10～50 μmol·L^-1冬凌草甲素能明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖，隨著藥物濃度增加其抑制作用越強（圖1）。

2.2 冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞早期凋亡的影響 冬凌草甲素作用MDA-MB-231細胞24 h可誘導其發生早期凋亡。對照組細胞的早期凋亡率為（1.5±0.9）%，藥物處理組的細胞早期凋亡率隨著冬凌草甲素濃度的增加而升高，20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素組的細胞早期凋亡率分別為（9.3±1.7）%，（15.4±2.1）%，（26.9±3.0）%，相比于對照組有顯著性差異（P<0.01）。

2.3 冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞總的細胞凋亡的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細胞48 h，收集細胞，PI染色流式細胞術檢測總的細胞凋亡情況。結果顯示，對照組的總的細胞凋亡率為（1.3±0.6）%，20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素可誘導乳腺癌細胞發生顯著的細胞凋亡，總的細胞凋亡率分別為（19.4±2.7）%，（39.7±2.8）%，（50.5±3.2）%，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。

2.4 冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞內ROS水平的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細胞5 h，收集細胞，流式細胞儀測定細胞內ROS水平的變化。結果表明，與對照組相比，冬凌草甲素能顯著升高細胞內ROS水平，隨著藥物濃度增加其升高ROS的作用越強（圖2）。

2.5 冬凌草甲素對乳腺癌MDA-MB-231細胞PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白表達的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細胞24 h，采用Western blot觀察凋亡相關蛋白PARP，Bcl-2，caspase-3的表達情況。結果顯示，冬凌草甲素處理乳腺癌細胞后可下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進caspase-3及其底物PARP的切割（圖3）。

3 討論

ROS依據其分子類型的不同可分為非離子型和離子型，包括過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子自由基、單線態氧、烷過氧化自由基、脂過氧化自由基等。細胞內氧化還原狀態的平衡對于細胞的存活及功能至關重要，低水平的ROS在維持細胞內穩態中發揮了重要作用[13]。研究表明，在腫瘤的發生發展進程中，細胞內的氧化還原狀態通常發生異常變化，引起腫瘤細胞內ROS水平的升高[14]。升高的ROS不僅使腫瘤細胞更易于發生基因突變，且使腫瘤細胞對異常升高的ROS較正常細胞更為敏感[15]。許多抗腫瘤化合物可通過升高細胞內ROS誘導腫瘤細胞發生凋亡[16-17]。通過調節Bcl-2蛋白家族的磷酸化和泛素化，ROS可上調促凋亡蛋白的表達、下調抗凋亡蛋白的表達，進而誘導細胞凋亡[18]。Hildeman等報道，細胞內ROS的升高可通過下調Bcl-2蛋白的表達引起線粒體膜電位的下降，從而誘發細胞凋亡[19]。本實驗以DCFH-DA為細胞內ROS探針，檢測到冬凌草甲素可升高MDA-MB-231細胞內ROS水平，同時Western blot實驗結果顯示冬凌草甲素可下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示其可能通過升高細胞內ROS而下調Bcl-2的表達參與細胞凋亡的誘導。

細胞凋亡是受死亡信號調節并伴隨天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspases）活化的一種自主而有序的細胞死亡形式，是多基因嚴格調控的過程[20]。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中起著關鍵性作用，分為抗凋亡成員和促凋亡成員兩大類，前者包括Bcl-2，Bcl-XL，Mcl-1等，可保護線粒體膜的完整性；后者包括Bax，Bak，Bad等，可促使多種凋亡誘導因子的釋放，通過激活caspases觸發細胞凋亡[21]。caspases蛋白酶家族在細胞凋亡過程中發揮著重要作用，其中caspase-3是介導細胞凋亡的關鍵分子，該分子被上游信號Bcl-2等激活后可引發酶促級聯反應，通過切割其底物核蛋白PARP，導致細胞凋亡的發生[22]。本實驗中，冬凌草甲素處理MDA-MB-231細胞24 h，可下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并引發caspase-3和PARP的切割，提示冬凌草甲素可能通過提高線粒體膜的通透性、激活caspase-3而誘導細胞凋亡。

本實驗結果表明，冬凌草甲素可誘導MDA-MB-231細胞凋亡，其機制可能與升高細胞內ROS水平、下調Bcl-2的表達并激活caspase-3相關，但ROS下調Bcl-2表達的分子機制尚需進一步研究。

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[責任編輯 張寧寧]