現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

汪霖+邵筠喬

摘 要：昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)是一門(mén)交叉學(xué)科，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究和解釋昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)的問(wèn)題。在昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用較多的分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)有：同工酶（蛋白質(zhì)電泳）方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（PAPD）方法、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）及微衛(wèi)星標(biāo)記方法（SSR）及單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；技術(shù)；昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q968. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子進(jìn)化和群體遺傳學(xué)的理論、分子生物學(xué)的技術(shù)手段、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和數(shù)學(xué)的分析方法及其他學(xué)科的知識(shí)（如地理學(xué)、古氣候?qū)W等）去研究種群、進(jìn)化、生態(tài)、行為、分類(lèi)、生物地理演化、生物保護(hù)等學(xué)科領(lǐng)域的各種問(wèn)題。它主要通過(guò)大量使用分子生物學(xué)先進(jìn)的技術(shù)和方法，在分子水平上研究生態(tài)現(xiàn)象，闡明生態(tài)現(xiàn)象的分子機(jī)制。昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)就是以昆蟲(chóng)作為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)的原理與方法研究昆蟲(chóng)進(jìn)化和適應(yīng)機(jī)制的一門(mén)科學(xué)。它主要通過(guò)分子生物學(xué)的方法檢查昆蟲(chóng)種群或個(gè)體的遺傳變異，分析和解釋遺傳變異的特點(diǎn)與規(guī)律，揭示遺傳變異所反應(yīng)的規(guī)律性的東西，從而進(jìn)一步闡明昆蟲(chóng)之間一級(jí)昆蟲(chóng)與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。其研究的最典型特色是運(yùn)用分子遺傳標(biāo)記來(lái)檢測(cè)研究對(duì)象的遺傳變異特征，揭示昆蟲(chóng)的演化規(guī)律。

在昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用較多的分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)有：同工酶（蛋白質(zhì)電泳）方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）方法、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）及微衛(wèi)星標(biāo)記方法（SSR）及單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中，目前應(yīng)用最多，最簡(jiǎn)便的是SSR和SNP技術(shù)。下面我們主要介紹在昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究中幾種常用分子標(biāo)記方法。

1.同工酶方法的應(yīng)用

同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子結(jié)構(gòu)不同的一類(lèi)酶。自從Hunter和Markert創(chuàng)立同工酶酶譜技術(shù)后，同工酶譜的變化即可作為鑒定物種、研究分類(lèi)與進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)。在昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)發(fā)展之初，同工酶被廣泛應(yīng)用與昆蟲(chóng)的分類(lèi)、種群間抗性的遺傳變異等方面，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，同工酶技術(shù)已慢慢被淘汰。

2.RFLP技術(shù)的應(yīng)用

RFLP又叫作Restriction Fragment Length Polymorphism，即我們所說(shuō)的限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性，而且他作為第一代的生物分子類(lèi)標(biāo)記技術(shù)，這種技術(shù)是指通過(guò)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)處理不同生物個(gè)體的DNA，通過(guò)利用限制性?xún)?nèi)切酶的多種特異性來(lái)達(dá)到獲得不同的DNA片段的目的，這種技術(shù)一般是被應(yīng)用于分子雜交，放射性同位素的顯微技術(shù)中，而且也只是主要用于研究生物遺傳的研究中，自問(wèn)世以來(lái)已廣泛運(yùn)用于多門(mén)生物學(xué)科研究中。

在昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究中可以用于昆蟲(chóng)遺傳譜圖的分析、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及數(shù)量遺傳性狀等方面的研究。

3.RAPD技術(shù)的應(yīng)用

RAPD，俗名是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，它是由兩位美國(guó)科學(xué)家Wiliams和Welsh在1990年提出的，而且他們并不是研究的合作者，而是分開(kāi)研究的，這種技術(shù)又被稱(chēng)作任意引物PCR。對(duì)于RAPD來(lái)說(shuō)，它所使用的物質(zhì)是十分不相同的，但是對(duì)于現(xiàn)存的所有引發(fā)物來(lái)說(shuō)，他對(duì)于在DNA序列堿基序列上的特定結(jié)合位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，一旦這些特異性DNA位點(diǎn)達(dá)到了基因組分布的擴(kuò)增條件，他就會(huì)根據(jù)DNA堿基對(duì)的配位原則，完成DNA另一條鏈的合成。

4. AFLP技術(shù)的應(yīng)用

植物基因組的AFLP中的酶切，連接和pcr問(wèn)題，只要酶切出來(lái)能看到些許彌散，pcr就應(yīng)該能看出結(jié)果才對(duì)，AFLP技術(shù)的關(guān)鍵就是把握體系的問(wèn)題，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有自己的一套體系，照著做一般沒(méi)有問(wèn)題，分子標(biāo)記，就是純體力勞動(dòng)，做得很多一般就會(huì)有結(jié)果的，這是量變到質(zhì)變的過(guò)程。 做AFLP需要用到試劑盒，但試劑盒不如自己做省事，也沒(méi)必要。除非你做的量少。但是分子標(biāo)記要的就是大量重復(fù)性的勞動(dòng)。因此，試劑盒不如自己做省事，也沒(méi)必要，并且試劑盒中很重要的酶往往量不夠用，比如T4連接酶和內(nèi)切酶EcoR I，除非你做的量很少，且不需要摸索體系。酶切出來(lái)能看到些許彌散，pcr就應(yīng)該能看出結(jié)果，也不一定。接頭制作和連接體系也很重要，連接時(shí)間一般影響不是很大。

5.微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

微衛(wèi)星標(biāo)記ms是一類(lèi)由幾個(gè)（多為1-5個(gè)）堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。自1981年 Spritz 首先在珠蛋白中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列到今天微衛(wèi)星序列在生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)走過(guò)了近 30 多年的發(fā)展變化。其中，20 世紀(jì) 80、90 年代是微衛(wèi)星技術(shù)從開(kāi)始到逐漸成熟的關(guān)鍵階段。1982 年Hamada 等在研究真核生物基因組中 Z-DNA 形成時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新的重復(fù)因素——選擇性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys 等通過(guò)對(duì)小衛(wèi)星（minisatellite）的 DNA 指紋圖譜鑒定證明了串聯(lián)重復(fù)的 DNA 具有很高的長(zhǎng)度差異性。與此同時(shí)，Tautz 等的研究表明，這種“神秘而簡(jiǎn)單冶的 DNA 序列是遺傳變異的重要來(lái)源。1989 年Tautz 首次應(yīng)用了基于 PCR 的微衛(wèi)星分型技術(shù)。隨著微衛(wèi)星分子標(biāo)記的廣泛使用，科研工作者對(duì)其進(jìn)化、功能及在基因組中的分布等研究的了解迅速增加。近年來(lái)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記也被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。截至 2012 年 6 月，共有 16396個(gè)昆蟲(chóng)上微衛(wèi)星位點(diǎn)在 NCBI中記錄，其中雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲(chóng)的微衛(wèi)星登錄數(shù)量最多，占75%。 這些微衛(wèi)星被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)遺傳作圖、種群遺傳學(xué)研究、個(gè)體親緣關(guān)系鑒定等方面。

6.SNP在昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，又稱(chēng)單核苷酸多態(tài)性，指DNA序列中單個(gè)堿基的差別，堿基對(duì)由于排列方式不同，結(jié)合不同脫氧核苷酸對(duì)，這些核苷酸對(duì)構(gòu)成密碼子，密碼子則以不同的排列順序編碼蛋白質(zhì)，從而形成自然界多種多樣的生命。SNP在基因組可以劃分為兩種形式：

一是基因編碼區(qū)的功能性突變，主要分布在基因編碼區(qū)，故又稱(chēng)為cSNP，這類(lèi)SNP較少，其變異率僅占周?chē)蛄械?/5，但因其在遺傳疾病研究中具有重要意義而備受關(guān)注；

二是遍布于基因組的大量堿基變異。就現(xiàn)在來(lái)說(shuō)，SNP技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始廣泛用于昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)，包括昆蟲(chóng)種間鑒定，遺傳圖譜的分析、入侵害蟲(chóng)種群間親緣關(guān)系的區(qū)分等研究。

生態(tài)學(xué)的發(fā)展，SNP技術(shù)的萌芽是古人生態(tài)意識(shí)的總和，在古時(shí)，古人并不了解整個(gè)自然界，但是他們通過(guò)長(zhǎng)期的打魚(yú)，農(nóng)牧以及狩獵積累了大量的樸素的生態(tài)學(xué)知識(shí)，比如說(shuō)農(nóng)作物的生長(zhǎng)與季候的關(guān)系、常見(jiàn)的動(dòng)物有哪些習(xí)性等等，在公園前四世紀(jì)時(shí)，希臘學(xué)者亞里士多德就曾經(jīng)粗略的描述了動(dòng)物有種不同的棲息地，還根據(jù)動(dòng)物生活棲息地的特點(diǎn)將其分為了水棲和路棲，根據(jù)它的食性分成肉食和草食，還有雜食動(dòng)物等等。隨著人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)于生態(tài)的認(rèn)識(shí)不再僅僅局限于以往的知識(shí)積累，人們通過(guò)自己的主動(dòng)探究從而能夠獲得有關(guān)于自然界的種種知識(shí)，最后能夠形成一個(gè)全面的生態(tài)學(xué)理念極其生態(tài)學(xué)系統(tǒng)的認(rèn)知應(yīng)用。本文通過(guò)描述幾種技術(shù)在昆蟲(chóng)生態(tài)系統(tǒng)的運(yùn)用從而得到現(xiàn)在科技在生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用等等相關(guān)關(guān)系，這種應(yīng)用不僅使各種技術(shù)得到提高，還對(duì)我們生態(tài)系統(tǒng)的探索起著極大的作用。

參考文獻(xiàn)

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