龍血竭總黃酮對新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷作用的研究

程初勇　潘小妮　劉文靜　黃照河

[摘要]目的研究龍血竭總黃酮對新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。方法將30只新西蘭兔隨機分為三組，每組10只。采用結扎新西蘭兔左冠狀動脈前降支法，建立心肌缺血/再灌注損傷模型。觀察心肌組織HE染色的結構變化，測量左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax），檢測心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。結果龍血竭處理組心肌組織結構明顯好于缺血/再灌注組；缺血/再灌注組和龍血竭處理組+dp/dtmax均明顯低于假手術組（P<0.01），龍血竭處理組+dp/dtmax高于缺血/再灌注組（P<0.01）；缺血/再灌注組CK-MB水平明顯高于假手術組（P<0.01），龍血竭處理組CK-MB水平高于假手術組（P<0.05），并低于缺血/再灌注組（P<0.01）。結論龍血竭總黃酮能夠改善心肌缺血/再灌注損傷，保護心肌組織結構，穩定細胞膜結構，減少心肌CK-MB漏出，提高缺血/再灌注損傷模型心肌的收縮功能。

[關鍵詞]缺血/再灌注損傷；龍血竭總黃酮；左心室內壓最大上升速率；肌酸激酶同工酶

中圖分類號：R542.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2017）03-0203-03

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2017.03.15

據研究我國急性心肌梗死發生率2008年與2002年比較呈上升趨勢，冠心病死亡粗率城市地區上升2.40倍，農村地區上升2.84倍，2008年冠心病死亡粗率城市居民為91.41/10萬，農村居民為51.89/10萬。急性心肌梗死病死率升高的諸多因素中心功能不全是第一位危險因素。即使冠狀動脈血運重建技術日益完善，而血管再通后的死亡總人數逐年升高，有必要找到新的治療方法，降低血管再通后的死亡率。中藥是我國長期治病防病實踐過程中積累的寶貴財富，具有極大的應用價值。龍血竭是廣西傳統名貴壯藥，從百合科植物劍葉龍血樹的含脂木材提取得到的樹脂，其性溫、平，味甘，無毒。具有抗菌、抗痙攣、消炎及鎮痛等效果，還存在有抗糖尿病及抗腫瘤的活性，同時也具有增強免疫功能，促進皮膚修復、止血及增強血液循環等功效。此次實驗是通過新西蘭兔心肌缺血/再灌注模型，研究龍血竭總黃酮對新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷的保護作用，為治療心肌缺血/再灌注損傷找到新的治療措施，降低心肌梗死的死亡率。

1材料和方法

1.1動物：新西蘭兔，體重為2.0～3.0kg，雌雄不限。右江民族醫學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK桂2012-0003。

1.2分組、造模：將30只新西蘭兔隨機分成三組：假手術組、缺血/再灌注組、龍血竭處理組，雌雄不限，每組10只。假手術組與缺血/再灌注組每天0.9%氯化鈉注射液5ml灌胃，龍血竭處理組用龍血竭總黃酮180mg/kg·d溶于5ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃。手術前灌胃給藥，連續給予10天。手術前禁食12小時，按照1.0g/kg應用20%氨基甲酸乙酯耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔，仰臥位固定手術臺上，四肢皮下連接ECG-6511型心電圖機（上海光電醫用電子儀器有限公司），監測動物心電圖，剪去頸部毛發，切開皮膚，暴露氣管，行氣管插管，連接V-100型小型動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司X呼吸頻率：45～50次/分鐘，潮氣量16～20ml，呼吸比1：1）。參照Cheng文獻方法造模。造模過程中，Ⅱ導聯ST段弓背抬高，心肌組織變為暗紅色為造模成功。龍血竭總黃酮由桂林三金藥業藥品研究所提供，紅褐色粉末狀，應用0.9%氯化鈉注射液作為溶劑。20%氨基甲酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠），肌酸激酶同工酶（CK-MB）測定試劑盒（德賽診斷系統上海有限公司）。

1.3檢測指標：測量新西蘭兔左心室內壓最大上升速率（+dP/dtmax），采取血液和心肌組織標本所有實驗動物均在心肌再灌注2小時時，用15G注射針頭連接醫用動脈測壓管，動脈測壓管再連接到BL-420E+生物機能實驗系統（成都泰盟科技公司），將注射針頭直接從心尖部插入左心室，測量左室內壓，得到+do/dtmax。直接從右心房取5ml血液，離心得到血清，保存-20℃冰箱備用。將心臟分離出體外，選用顏色較深的左心室前壁心肌組織10%中性福爾馬林固定，以備HE常規染色。實驗全部結束后，利用日立7600全自動生化分析儀檢測血清CK-MB。

1.4統計學處理：應用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，再兩兩比較用LSD方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1缺血/再灌注對新西蘭兔心肌組織的影響：假手術組：心肌組織HE染色濃淡均勻一致，細胞核清晰可見，心肌纖維結構清楚，排列整齊有序（圖1A）；缺血/再灌注組：心肌組織HE染色程度濃淡不一，細胞核清晰度欠佳，心肌纖維排列紊亂，可見纖維斷裂現象，組織間紅細胞滲出（圖1B）；龍血竭處理組：心肌組織HE染色胞漿輕微濃染，心肌纖維較為清晰，結構比較規則，細胞核染色均勻，組織間可見少量紅細胞滲出（圖1C）。

2.2龍血竭總黃酮對+dp/dtmax、心肌CK-MB水平的影響：與假手術組比較，缺血/再灌注組+dp/dtmax明顯降低，具有統計學意義（P<0.01）；龍血竭處理組+dp/&max比假手術組明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；龍血竭處理組與缺血/再灌注組比較，龍血竭處理組+dp/dtmax明顯好于缺血/再灌注組（P<0.01）。假手術組檢測出心肌酶CK-MB，缺血/再灌注組與假手術組比較心肌酶CK-MB水平明顯升高，具有統計學意義（P<0.01）；龍血竭處理組比假手術組心肌酶CK-MB水平明顯升高，具有統計學意義（P<0.05）；龍血竭處理組與缺血/再灌注組比較，心肌酶CK-MB水平明顯比缺血/再灌注組降低，并具有統計學意義（P<0.01）。

3討論

心肌缺血/再灌注損傷作用機制復雜，涉及到很多生理病理過程：氧化應激、能量代謝障礙、心肌細胞凋亡、鈣超載、自噬、細胞浸潤及血管內皮功能障礙等。在Li等的研究中證實心肌缺血/再灌注后，心肌Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）和細胞核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）的表達均顯著增加，降低B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma2，Bcl-2）蛋白表達水平，并增加Bcl-2相關蛋白x（Bc1-2-associatedx，Bax）表達，誘導心肌細胞凋亡；而Yi掣的研究中證實，龍血竭增加Bcl-2表達，降低Bax蛋白表達，從而保護心肌細胞，這種保護作用是通過抑制細胞外信號調節激酶/NF-кB/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1/Bax[extracellular signalregulated kinase/NF-kB/poly（ADP-ri-bose）polymerase-1/Bax，ERK/NF-kB/PARP-1/Bax]信號傳導級聯，隨后抑制血管細胞黏附分子-1（vascularcell adhesion molecule 1，VCAM-1）的活化而實現的。龍血竭保護心肌的作用機制可能涉及多個方面，本實驗從心肌組織HE染色可以看出，缺血/再灌注組心肌組織結構損傷明顯，而應用龍血竭總黃酮干預后，心肌組織結構明顯好于缺血/再灌注組，由此證實在組織解剖層面上龍血竭總黃酮可以保護缺血/再灌注后的心肌組織。

糖尿病會損傷全身血管，并發心腦血管疾病，是冠心病的一個高危因素。糖尿病血管損害的病理機理與心肌缺血/再灌注損傷的病理機理有著許多共同的發病機制：氧化應激、能量代謝障礙、細胞凋亡、細胞浸潤及血管內皮功能障礙等。其中糖尿病侵害皮膚血管，并發皮膚潰瘍，而龍血竭能夠促進糖尿病大鼠潰瘍創面愈合優于胰島素對照組；還有研究證實，龍血竭含有的酚類化合物和生物堿類是傷口愈合時間縮短的主要成分。龍血竭總黃酮對大鼠、犬急性心肌缺血有較好的保護作用，對乳鼠心肌缺血/再灌注損傷也有顯著的保護作用。龍血通絡膠囊含有龍血竭成分，龍血通絡膠囊可以改善高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠的紅細胞可變形性、紅細胞滲透脆性，降低紅細胞膜的脂質過氧化，從而改善高膽固醇血癥的微循環。既然龍血竭能夠治療糖尿病皮膚并發癥，對犬、大鼠、乳鼠的心肌缺血有著較好的保護作用，預示著龍血竭同樣可以治療心肌缺血/再灌注損傷時遭受損害的心肌收縮功能。+dp/dtmax是反映左心收縮功能比較穩定的一個指標，較少受到心臟前后負荷的影響。前述研究證實龍血竭可以抑制缺血/再灌注心肌細胞凋亡，保護心肌組織結構完整，降低血管通透性，減輕組織水腫，本實驗龍血竭處理組+dp/dtmax明顯好于缺血/再灌注組，證實龍血竭總黃酮在心肌缺血/再灌注時具有保護左心室收縮功能的作用。

心肌CK-MB水平是診斷心肌梗死的酶學指標之一，具有較強的特異性。此次實驗，假手術組心肌CK-MB水平也有檢出，可能因為骨骼肌創傷所致。實驗中，缺血/再灌注組CK-MB水平升高最為明顯，而龍血竭處理組較假手術組CK-MB水平有顯著性升高，但比缺血/再灌注組低，由此得出龍血竭總黃酮可以降低新西蘭兔缺血/再灌注模型心肌CK-MB水平。

本研究表明，龍血竭總黃酮能夠改善心肌缺血/再灌注損傷，保護心肌組織結構，保持細胞膜穩定，減少心肌酶CK-MB漏出，提高耐受能力，從而保護心肌的收縮功能。本研究為治療心肌缺血/再灌注損傷提供了一個新的線索，但需進一步深入研究其作用的分子機制。