Cat B和Cys C在食管癌組織中的表達

閆 焱，周 昆，易巧麗，樊青霞

(1.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

Cat B和Cys C在食管癌組織中的表達

閆 焱1，周 昆2，易巧麗1，樊青霞1

(1.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

目的 探討組織蛋白酶B(Cat B)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)在食管癌組織中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組化及熒光定量PCR對56例食管癌及相對應的癌旁正常食管黏膜組織中Cat B和Cys C表達進行檢測。結果 與癌旁正常食管黏膜組織比較，食管癌組織中Cat B和Cys C的mRNA和蛋白表達均明顯上調(P<0.05)。Cat B和Cys C的表達顯著正相關(rs=0.970，P<0.05)。Cat B 和Cys C的表達均與淋巴結轉移有關，Cys C的表達還與腫瘤侵襲程度有關(P<0.05)。結論 Cat B和Cys C在食管癌組織中均呈高表達，且其高表達與腫瘤惡性程度相關，有望成為食管癌早期診斷及預后判斷的分子標志物。

組織蛋白酶B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；食管癌

食管癌是世界范圍內排名前10位的最常見惡性腫瘤之一，也是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。中國是食管癌的高發地區，其死亡率僅次于胃癌。惡性腫瘤侵襲和轉移常常是造成患者死亡的主要原因。組織蛋白酶B(Cathepsin B,Cat B)是一種溶酶體內的半胱氨酸蛋白水解酶，其通過參與細胞外基質蛋白的降解,促進腫瘤細胞侵襲轉移過程和腫瘤血管生成等途徑在惡性腫瘤的發展中扮演著重要角色[1-3]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C,Cys C)作為組織蛋白酶抑制劑與組織蛋白酶互相作用在腫瘤的發生、發展中起到十分重要的作用[4-6]。本試驗研究Cat B和Cys C在人食管癌組織中的表達，以評估Cat B和Cys C作為食管癌早期診斷分子標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 選取2009年3月至2011年5月鄭州大學第一附屬醫院收治的經病理學確診的56例食管癌患者及其配對癌旁正常食管黏膜組織的手術切除標本。正常食管黏膜組織取自切除食管斷端，距腫瘤切緣約5 cm，均經病理學確認為正常食管黏膜組織。所有患者術前均未接受化療、放療或中藥等其他針對腫瘤的治療，新鮮組織采用手術分離并在術后立即置于液氮中，部分組織常規石蠟包埋。56例患者基線資料：男31例，女25例；年齡36～77歲，中位年齡為59.5歲；鱗癌39例，腺癌16例；高分化11例，中分化25例，低分化組20例；浸潤深度：T1(腫瘤只侵及黏膜下層或黏膜固有層)6例，T2(腫瘤侵及肌層)18例，T3(腫瘤侵及纖維膜)18例，T4(腫瘤侵及臨近結構)14例；無淋巴結轉移20例，有淋巴結轉移36例。

1.2 免疫組化檢測中Cat B和Cys C表達 將標本石蠟切片脫蠟，浸入0.01 mol·L-1構椽酸鹽緩沖液中，加熱95 ℃保持15 min，滴加體積分數3%過氧化氫，室溫下避光孵育。滴加Cat B和Cys C一抗(武漢三鷹生物技術有限公司，1100)，入濕盒內4 ℃過夜。次日滴加生物素標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復染，質量分數1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，選用癌旁正常食管黏膜做切片內陰性對照，陽性對照片由抗體公司提供。分別由2位經驗豐富的病理科醫生在不知標本臨床和病理資料的情況下獨立觀察切片，對免疫組化結果進行評分。意見一致者予以采納，意見不一致者重新商定。Cat B和Cys C陽性細胞均以細胞呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為準，著色高于背景，或背景不著色而細胞質著色為陽性。采用Mattern的半定量積分法：根據著色深淺程度及著色陽性上皮細胞所占百分比(%)，對表達強度進行半定量評估分級，分為-、±、+、++，其中-為陰性，±、+、++為陽性。

1.3 熒光定量PCR檢測Cat B和Cys C mRNA表達 Trizol試劑提取組織中RNA，用反轉錄試劑盒進行反轉錄為cDNA，根據Cat B和Cys C的cDNA序列設計熒光定量PCR引物，Cat B-QF，GCTACAGCCCGACCTACAAACAG，Cat B-QR，GAGCAGGAAGTCCGAATACACAGA，Cys C-QF CCGTCGGCGAGTACAACAAAG，Cys C-QR CCA-GCTCCACGTCCAAGAAGTAGT，GADPH-QF，AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，GADPH-QR，AGGGGCCATCCACAGT-CTTC。然后進行熒光定量PCR擴增反應，結果采用2-ΔΔCt進行計算。

2 結果

2.1 免疫組化檢測組織樣本中Cat B和Cys C蛋白的表達 Cat B和Cys C在食管癌及癌旁正常食管黏膜組織中均有不同程度的表達。Cat B主要著色于細胞質與鄰近細胞膜，食管癌和癌旁正常食管黏膜組織中蛋白陽性率分別為60.7%(34/56)及19.6%(11/56)(χ2=19.651，P<0.001)。食管癌組織中Cys C主要著色于細胞質中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，少數細胞膜亦有表達，一些癌旁正常上皮組織中亦有較弱表達，食管癌和癌旁正常食管黏膜組織中Cys C蛋白陽性率分別為94.6%(53/56)及12.5%(7/56)(χ2=75.959，P<0.001)。食管癌組織中Cat B和Cys C的表達顯著正相關(rs=0.970，P<0.05)。見圖1。

2.2 食管癌組織中Cat B和Cys C的蛋白表達強度與臨床病理特征的關系 Cat B 和Cys C的表達均與淋巴結轉移有關，Cys C的表達還與腫瘤侵襲程度有關(P<0.05)。見表1。

2.3 熒光定量PCR檢測組織樣本中Cat B和Cys C mRNA表達 以每例樣本自身癌旁正常食管黏膜組織為對照，食管癌組織中Cat B和Cys C mRNA的相對表達量均明顯升高(t=3.225，P<0.001)。見圖2。

3 討論

惡性腫瘤的特征性表現是浸潤和轉移，腫瘤細胞產生的半胱氨酸蛋白酶等多種水解酶能降解細胞外基質，破壞黏膜屏障，促使腫瘤細胞穿透基底膜向深層組織浸潤及遠處轉移[7]。存在于細胞質溶酶體中的Cat B屬于半胱氨酸蛋白酶的一種，可降解多種細胞外基質，如多型膠原、纖連蛋白等，參與腫瘤的浸潤和轉移。Cat B在前列腺癌、頭頸部癌、肺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中表達增高[8-11]。Cys C是Cat B最主要的抑制劑，可以與半胱氨酸蛋白酶結合形成酶-抑制劑復合物，從而阻止Cat B對間質組織及基底膜的破壞作用，抑制腫瘤細胞的侵襲能力[12-13]。Cys C在多種惡性腫瘤組織及細胞中表達上調，例如卵巢癌、非小細胞肺癌等[14-15]。然而，Yano等[7]在乳腺癌組織中得到了相反的結論。同樣，Kothapalli等[16]發現在大顆粒淋巴細胞白血病中Cys C基因表達下調。

圖1 Cat B(A:食管癌；B：癌旁)和Cys C(C:食管癌；D：癌旁)在不同食管組織中的表達(S-P，×400)

組別nCatB-±+++CysC-±+++腫瘤分化程度 高分化1153212432 中分化251247216126 低分化20538403107腫瘤侵襲程度 T1+T224123721896 T3+T43210710525169淋巴結轉移 無2074632765 有36156114161910

注：Cat B：腫瘤分化程度χ2=3.927,P=0.140；腫瘤侵襲程度Z=1.022,P=0.307；淋巴結轉移Z=4.191,P<0.001。Cys C：腫瘤分化程度χ2=4.636,P=0.098; 腫瘤侵襲程度Z=3.118,P=0.002；淋巴結轉移Z=4.930,P<0.001

本研究發現食管癌組織中Cat B和Cys C蛋白及mRNA水平均較癌旁正常食管黏膜組織升高，并且食管癌組織中兩者的表達顯著正相關。Cys C表達水平的升高，可能是由于機體反饋調節機制的結果，食管癌組織中Cat B表達增加，會反饋性引起Cys C表達的增多，而增加的Cys C抑制了Cat B的活性，以降低腫瘤細胞的浸潤侵襲能力。我們的研究還發現，Cat B和Cys C的表達均與食管癌淋巴結轉移有關，Cys C的表達還與腫瘤侵襲程度有關，這提示Cat B和Cys C與食管癌發生、發展機制密切相關。

總之，Cat B 和Cys C在食管癌組織中均顯著高表達，可以作為食管癌早期診斷的分子標志物之一。探索Cat B和Cys C對食管癌發生、發展的具體作用及機制，可以為食管癌分子靶向治療提供新的思路及方向。

圖2 Cat B(左)和Cys C(右)mRNA在不同食管組織中的表達

[1] MONSOUVANH A,PROUNGVITAYA T,LIMPAIBOON T,et al.Serum Cathepsin B to Cystatin C ratio as a potential marker for the diagnosis of cholangiocarcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014,15(21):9511-9515.

[2] 王亞飛，程愛蘭.Cathepsin D與惡性腫瘤的關系[J].腫瘤基礎與臨床,2014,27(1)：79-81.

[3] DECOCK J,OBERMAJER N,VOZELJ S,et al.Cathepsin B,Cathepsin H,Cathepsin X and Cystatin C in sera of patients with early-stage and inflammatory breast cancer[J].Int J Biol Markers,2008,23(3):161-168.

[4] VIGNESWARAN N,WU J,MULLER S,et al.Expression analysis of Cystatin C and M in laser-capture microdissectioned human breast cancer cells-a preliminary study[J].Pathol Res Pract,2005,200(11/12):753-762.

[5] NISHIKAWA H,OZAKI Y,NAKANISHI T,et al.The role of Cathepsin B and Cystatin C in the mechanisms of invasion by ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2004,92(3):881-6.

[6] ZORE I,KRASOVEC M,CIMERMAN N,et al.Cathepsin B/Cystatin C complex levels in sera from patients with lung and colorectal cancer[J].Biol Chem,2001,382(5):805-810.

[7] YANO M,HIRAI K,NAITO Z,et al.Expression of Cathepsin B and Cystatin C in human breast cancer[J].Surg Today，2001,31(5):385-389.[8] 王蕾，陳凌燕，劉華，等．半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在胃腸道腫瘤組織中表達的研究[J]．中華檢驗醫學雜志，2006，29(12)：1133-1136.

[9] 楊正多，張丹，呂宏程，等．Stathmin及Cathepsin B在結直腸癌中的表達[J].中華結直腸疾病電子雜志，2015，4(1)：45-48.

[10]何訸，呂瑞雪，胥勁，等．半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在原發性肝癌組織中表達的初步研究[J].四川大學學報(醫學版)，2013，44(6)： 920-923.

[11]陳肇杰,陳曉香.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測對腫瘤化療患者早期腎損傷的診斷意義[J].臨床和實驗醫學雜志，2013，12(11)：843-844.

[12]CHEN Q,FEI J,WU L,et al.Detection of cathepsin B,cathepsin L,cystatin C,urokinase plasminogen activator and urokinase plasminogen activator receptor in the sera of lung cancer patients[J].Oncol Let,2011,2(4): 693-699.

[13]NAUMNIK W,NIKLISKA W,OSSOLISKA M,et al.Serum cathepsin K and cystatin C concentration in patients with advanced non-small-cell lung cancer during chemotherapy[J].Folia Histochem Cytobiol,2009,47(2):207-213.

[14]JIBORN T,ABRAHAMSON M,GADALEANU V,et al.Aberrant expression of cystatin C in prostate cancer is associated with neuroendocrine differentiation[J].BJU Int,2006,98(1): 189-196.

[15]PETTY RD,KERR KM,MURRAY GI,et al.Tumor transcriptome reveals the predictive and prognostic impact of lysosomal protease inhibitors in non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2006，24(11): 1729-1744.

[16]KOTHAPALLI R,BAILEY RD,KUSMARTSEVA I,et al.Constitutive expression of cytotoxic proteases and down-regulation of protease inhibitors in LGL leukemia[J].Oncol，2003，22(1):33-39.

Expressions of Cat B and Cys C in the Esophageal Carcinoma

YAN Yan1,ZHOU Kun2,YI Qiaoli1,FAN Qingxia1

(1.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the expressions of Cathepsin B(Cat B) and Cystatin C(Cys C) gene in the esophageal carcinoma.Methods Fifty-six patients with esophageal carcinoma were randomly collected,and the Cat B and Cys C expressions of esophageal carcinoma and matched normal esophageal mucosal samples were were determined by immunohistochemistry and qRT-PCR.Results Compared with normal esophageal mucosal tissues,mRNA and protein levels of Cat B and Cys C in the esophageal carcinoma tissues were significantly increased (P<0.05).Cat B was positively related with Cys C in the esophageal carcinoma tissues(rs=0.970，P<0.05).The expressions of Cat B and Cys C were related with lymph node metastases and the expression of Cys C was related with degree of tumor invasion(P<0.05).Conclusion These results show that mRNA and protein levels of Cys C in esophageal carcinoma tissues were significantly increased.They are expected to be a molecular marker for the early diagnosis of esophageal carcinoma.Cat B and Cys C expression were high in the esophageal carcinoma,and their high expressions are related to tumor malignant degree,and Cat B and Cys C can be used as the early diagnostic and prognostic molecular markers of esophageal carcinoma.

Cat B; Cys C; esophageal carcinoma

國家自然科學基金資助項目(編號：81672424)；河南省科技攻關項目(編號：201702010)

閆焱(1982-)，女，博士，主要從事食管癌的基礎與臨床研究。E-mail：happyyy0721@163.com

樊青霞(1952-)，女，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事腫瘤基礎與臨床研究。E-mail: baihe3@tom.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.03.001

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2017)03-0185-04

2016-12-23)