基于Th1細胞功能研究中藥合地塞米松對哮喘大鼠pJAKs/pSTATs的影響*

唐秀鳳 李曉曦 年宏蕾 楊 燕 許利平 王秀娟 劉仁慧

（首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069）

·研究報告·

基于Th1細胞功能研究中藥合地塞米松對哮喘大鼠pJAKs/pSTATs的影響*

唐秀鳳 李曉曦 年宏蕾 楊 燕 許利平 王秀娟 劉仁慧△

（首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069）

目的 觀察中藥淫羊藿女貞子煎劑及提取物配伍地塞米松對哮喘大鼠肺組織中與Th1細胞信號通路相關的JAKs及STATs蛋白磷酸化表達的影響。方法 SPF級雄性大鼠，隨機分為正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、地塞米松組（C組）、淫羊藿女貞子煎劑組（D組）、地塞米松合煎劑組（E組）、淫羊藿女貞子提取物組（F組）、地塞米松合提取物組（G組）。卵蛋白致敏，激發建立大鼠哮喘模型，腹腔注射地塞米松和/或灌胃淫羊藿女貞子煎劑或提取物，免疫熒光法檢測肺組織JAKs（JAK1、JAK2）及STATs（STAT1、STAT2、STAT4）蛋白的磷酸化表達。結果 與A組比較，B組大鼠肺組織pJAK1、pSTAT1、pSTAT2蛋白表達均顯著升高（均P＜0.01），pJAK2、pSTAT4蛋白表達顯著降低（均P＜0.01）；與B組比較，各給藥組pJAK1、pSTAT1、pSTAT2蛋白表達顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），pJAK2、pSTAT4蛋白表達顯著升高（均P＜0.01）；與C組比較，E組、G組能pJAK1、pSTAT1、pSTAT2的蛋白表達顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），pJAK2、pSTAT2的蛋白表達顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與單用地塞米松比較，地塞米松合煎劑或提取物組能顯著性調整pJAK1、pJAK2、PSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白的表達。結論 調節哮喘大鼠肺組織中與Th1細胞信號通路相關的JAKs/ STATs可能是淫羊藿女貞子煎劑及提取物協同激素治療哮喘的作用機制之一。

哮喘 淫羊藿 女貞子 地塞米松 JAKs STATs

近幾十年來，支氣管哮喘等變態反應性疾病的發病率呈持續性上升趨勢。目前，糖皮質激素（GC）仍然是防治哮喘的首選藥，但長期大劑量的應用產生的激素耐藥及副作用給臨床診治帶來諸多問題［1］。JAK（JAKs）/信號傳導及轉錄活化因子（STAT）信號通路與哮喘密切相關，在炎癥反應和免疫調節中起重要作用，尤其對T淋巴細胞（Th）分化起主要作用，若異常表達則導致Th1/Th2失衡 （Th1細胞減少或功能低下，Th2細胞增多或功能亢進），從而介導了哮喘的一系列變態反應［2］。本研究選用與Th1細胞減少或功能低下相關的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT4 5個蛋白為研究對象，探索平補陰陽藥對淫羊藿、女貞子合用GC治療哮喘的作用，為中西醫結合治療哮喘提供實驗基礎。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠42只，雄性，體質量（120±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。SPF級動物環境，自由飲水、攝食。

1.2 試藥與儀器 卵蛋白（美國Sigma公司，A5253-100g），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司，A8222-250 mL），地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團容生制藥有限公司，批號：H41020036，5 mg/支），異硫氰酸熒光（FITC）標記二抗 （北京成文免疫化學研究室，批號：L3202），pJAK1（Santa Cruz Biotechnology，10514），pJAK2（Santa Cruz Biotechnology，J2314），pSTAT1（Cell Signaling，批號：21），pSTAT2（Cell Signaling Technology，批號：1），pSTAT4（Cell Signaling，J0710）。淫羊藿煎劑（西安康威生物有限，批號：20130115）、女貞子煎劑（西安康威生物有限，批號：20130104），淫羊藿、女貞子提取物均由上海一林生物科技有限公司提供，制備方法參考文獻［3］。超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備有限公司，402A），霧化箱（以有機玻璃為材料自制，規格：40×30×20cm3），NIkon生物顯微鏡及NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件（ECLIPSE 80i，北京銳馳恒業儀器科技有限公司），全自動脫水機（德國，LEICA ASP30），包埋機（德國，LEICA EG1150H），切片機（德國，LEICA RM2235）。

1.3 分組與造模 按照隨機數字表法將大鼠分為正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、地塞米松組（C組）、淫羊藿女貞子煎劑組（D組）、地塞米松合煎劑組（E組）、淫羊藿女貞子提取物組（F組）、地塞米松合提取物組（G組），每組6只。于實驗第1天、第8天，除正常組外，其余各組均造模［4］。造模成功后，各造模組均每周2次給予1%的卵蛋白霧化吸入，A組霧化生理鹽水溶液，直至實驗結束。實驗第22天開始給藥，共計2周，C組、E組、G組腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D組及E組灌胃淫羊藿女貞子煎劑（淫羊藿質量∶女貞子質量=4∶3，0.35 g/kg生藥）；F組及G組灌胃淫羊藿女貞子提取物（淫羊藿質量∶女貞子質量=2∶3，100 mg/kg），均每日1次。

1.4 觀察指標 實驗第36天處死所有動物，開胸，快速取出肺組織。切成厚度約3 mm的組織塊，置10%的甲醛溶液內固定24 h。常規石蠟包埋，制片。免疫熒光法檢測大鼠肺組織中JAKs（JAK1、JAK2）、STATs（STAT1、STAT2、STAT4）蛋白的磷酸化表達。一抗均用PBS按照1∶50的比例稀釋。FITC-熒光二抗用PBS按照1∶100的比例稀釋。光鏡200倍觀察，隨機選取3個視野。結果判斷：測定其陽性面積（Area）和積分光密度（IOD），取均值代表各細胞因子的表達水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS 17.0 for Windows統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane’s T2（方差不齊）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠pJAK1、pJAK2蛋白表達的比較 見表1。與A組相比，B組大鼠肺組織pJAK1蛋白表達的Area和IOD值均顯著上調 （均P＜0.01），pJAK2蛋白表達的Area和IOD均顯著下調（均P＜0.01）。與B組比較，各給藥組pJAK1蛋白表達的Area和IOD值均顯著下調 （均P＜0.01），pJAK2蛋白表達的Area和IOD均顯著升高（均P＜0.01）。與C組比較，E組和G組pJAK1蛋白表達的Area和IOD進一步顯著降低（均P＜0.01），pJAK2蛋白表達的Area和IOD值顯著升高（均P＜0.01）。與單用地塞米松比較，地塞米松合煎劑或提取物組均對pJAK1、pJAK2的蛋白表達有顯著影響（均P＜0.01）。2.2 各組大鼠pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表達的比較 見表2。與A組比較，B組大鼠pSTAT1和pSTAT2蛋白表達顯著上升（均P＜0.01），pSTAT4蛋白表達顯著降低（均P＜0.01）；與B組比較，5個給藥組均能pSTAT1和pSTAT2的蛋白表達顯著降低（均P＜0.01），pSTAT4的蛋白表達顯著升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與C組比較，E組和G組對pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4的蛋白表達有顯著調整（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組大鼠表達的pJAK1、pJAK2的蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠表達的pJAK1、pJAK2的蛋白表達比較（±s）

與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與C組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

pJAK1pJAK2組別 n Area（μm2） IOD Area（μm2） IOD A組 6 20.59±0.73 164.49±6.13 10.52±0.13 83.72±1.16 B組 6 C組 6 24.48±1.24**195.70±9.36**14.54±1.20△△115.14±9.31△△7.51±0.14**59.26±1.10**8.43±0.07△△66.83±0.67△△D組 6 17.09±0.69△△▲▲136.18±5.75△△▲▲8.91±0.10△△▲▲70.76±1.22△△▲▲E組 6 17.79±0.42△△▲▲142.40±3.39△△▲▲9.52±0.29△△▲▲75.93±2.23△△▲▲F組 6 18.21±0.51△△▲▲144.99±4.48△△▲▲9.69±0.11△△▲▲77.05±1.05△△▲▲G組 6 20.49±1.14△△▲▲163.57±8.74△△▲▲10.17±0.07△△▲▲80.82±0.63△△▲▲

表2 各組大鼠表達的pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表達的比較（±s）

表2 各組大鼠表達的pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表達的比較（±s）

pSTAT1pSTAT2 pSTAT4組別 n n Area（μm2） Area（μm2） IOD Area（μm2） IOD A組 5 8.79±1.35 6 214.17±2.64 280.15±2.90 20.56±0.58 164.90±4.37 B組 5 16.75±1.52**6 279.83±2.64**366.83±3.52**15.22±0.54**124.65±9.26**C組 5 12.44±2.75△△6 221.00±4.05△△289.91±5.55△△16.74±0.48 134.01±4.17△D組 5 11.40±0.68△△6 222.00±4.56△△291.39±6.48△△17.30±1.24△△▲136.97±5.14△△E組 5 12.44±0.64△△6 216.00±1.41△△▲▲282.61±1.74△△17.75±0.48△△141.61±4.47△△▲F組 5 12.76±1.65△△6 218.83±1.72△△286.34±2.33△△18.54±1.01△△▲▲148.50±7.90△△▲▲G組 5 9.44±2.39△△▲6 212.00±1.26△△▲▲279.11±1.51△△19.81±1.22△△▲▲158.95±9.60△△▲▲

3 討 論

支氣管哮喘是一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，多種細胞因子和炎性介質是其病理生理過程形成的始動和維持因素［5］。前期研究發現，IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細胞的特征性細胞因子，淫羊藿女貞子通過影響IL-4/IFN-γ水平從而糾正哮喘大鼠肺組織中的Th1/Th2功能失衡［5］。隨著研究進展，細胞信號傳導途徑對哮喘的作用越來越受到重視，成為揭示哮喘發病機制的一個新的可能途徑。

近年來的研究認為輔助性Th兩種亞型Th1、Th2的失衡是哮喘發病的重要機制［6］。這兩類轉錄因子介導細胞因子轉錄，均通過JAK-STAT信號通路實現。JAKs是一種蛋白酪氨酸激酶［7］，它可在細胞因子受體與相應配基結合后活化，進而激活另一種信號蛋白分子“STAT”而誘導目的基因表達［8］。STAT是一類在胞質中能被眾多細胞外多肽類分子激活，參與基因轉錄調控的蛋白質家族。STAT是JAK/STAT信號通路的核心分子，磷酸化的STAT可穿過核膜進入核內，從而調節相關基因的表達［9］。JAK1、JAK2廣泛分布于人和小鼠中，當哮喘發生時，大量與炎癥相關的細胞因子被激活，JAK1蛋白表達增加，JAK2蛋白表達減少［10］。研究表明，STAT1、STAT2參與Th1型細胞因子信號轉導的抑制。STAT1是STAT家族中第一個被發現的成員，主要參與INFs的應答反應，STAT1存在時IFN-γ可通過調節氣道炎癥和免疫應答發揮作用。當哮喘發生時，抑制Th1細胞因子分泌，促進STAT1磷酸化蛋白的表達［11］。STAT2僅被IFN-α/β和IFN-λs活化，一般認為STAT1與STAT2形成二聚體而參與哮喘的發病過程。STAT4是Th1分化的必需轉錄因子，哮喘時被抑制［12］。細胞因子對STAT的激活具有一定選擇性，如IL-12、IL-23、IFN-α激活STAT4［13］。信號傳導及轉錄激活因子STAT4在Th1細胞分化以及功能發揮中起重要作用［14-16］，并通過相應JAK途徑激活，STAT4接受細胞外IFN-12的信號，從而使STAT4磷酸化。綜上所述，本實驗中，STAT家族中STAT1、STAT2、STAT4與Th1細胞分化有關，故從與Th1細胞信號通路有關的幾個指標研究淫羊藿女貞子藥對協同地塞米松的抗炎作用。本實驗結果表明，與正常大鼠比較，哮喘模型大鼠JAK1、STAT1、STAT2磷酸化蛋白表達顯著上升，這與哮喘發病過程中大量與炎癥相關細胞因子的激活相吻合，而JAK2磷酸化蛋白表達下降，推測哮喘過程中Th1類細胞因子IFN-γ的分泌受到抑制，而IFN-γ為活化pJAK2細胞因子之一，IFN-γ的分泌降低導致JAK2的活化表達減少。同樣模型組大鼠STAT4的磷酸化表達顯著降低。STAT4被認為是調控Th0細胞向Th1方向分化的細胞因子的主要轉錄因子［17］，STAT4磷酸化表達不足會導致Th1分化信號轉導不充分，認為STAT4是生成Th1細胞必須的。給予藥物后，5個給藥組均能顯著調整pJAKs、pSTATs的蛋白表達，抑制 JAK1、STAT1、STAT2的磷酸化蛋白表達，增加JAK2、STAT4的磷酸化蛋白表達，與單用地塞米松比較，地塞米松合煎劑組或合提取物組對JAKs、STATs各蛋白的磷酸化表達的調節作用更優，提示口服中藥淫羊藿女貞子合用地塞米松具有協同增效關系。

本課題通過對與Th1信號通路相關的JAKs與STATs蛋白的磷酸化表達進行研究，認為哮喘發病過程中出現的Th1細胞減少或者功能低下等與JAKs激活和活化pSTATs的調控有關。在地塞米松治療哮喘的同時合用中藥淫羊藿女貞子，可通過調節與Th1細胞信號通路相關的JAKs/STATs蛋白的磷酸化表達產生協同增效的治療作用。

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Effects of Traditional Chinese Medicine Combined with Dexamethasone on pJAKs/pSTATs in AsthmaticRats Based on Th1 Cell Function

TANG Xiufeng，LI Xiaoxi，NIAN Honglei，et al. School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective：To study the effects of the decoction and extracts of Epimedium and Fructus Ligustri lucidi（EF）on JAKs/STATs protein phosphorylation which was connected with Th1 cell signaling pathways in lung tissues of asthmatic rats atomized by dexamethasone.Methods：The SPF rats were randomly divided into seven groups，including normal control group （A group），asthma model group（B group），dexamethasone group（C group），EF decoction group （D group），EF decoction plus dexamethasone group（E group），EF extracts group（F group），and EF extracts plus dexamethasone group（G group）.Asthmatic rat model was duplicated by injection and atomization inhalation of OVA.And treatment was applied by intraperitoneal injection of dexamethasone and/ or gavage with EF decoction or EF extracts.The phosphorylation protein expressions of JAKs（including JAK1，JAK2）and STATs（including STAT1，STAT2，and STAT4）of lung tissues were detected in rats of all groups by the method of immunofluorescence.Results：Compared with A group，the protein expression of pJAK1，pSTAT1 and pSTAT2 in lung tissue were significantly increased（all P＜0.01）in B group，and the protein expression of pJAK2 and pSTAT4 were also significantly decreased（all P＜0.01）.Compared with B group，the protein expression of pJAK1，pSTAT1 and pSTAT2 in five treatment groups were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01），and the protein expression of pJAK2 and pSTAT4 increased significantly（all P＜0.01）.Compared with C group，E group，G group could significantly reduce the protein expression of pJAK1，pSTAT1，pSTAT2（P＜0.05 or P＜0.01），and significantly increase pJAK2 and pSTAT2 protein expression（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with dexamethasone group，the EF decoction plus dexamethasone group or EF extracts plus dexamethasone group had abetter effect on the protein expression of pJAK1，pJAK2，pSTAT1，pSTAT2，pSTAT4 protein.Conclusion：Combination of dexamethasone with EF may produce a synergistic interaction effect on asthma by adjusting JAKs/STATs protein phosphorylation expression which is connected with Th1 cell signaling pathways.

Asthma；Herba Epimedium；Fructus Ligustri lucidi；Dexamethasone；JAKs；STATs

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0753-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.001

2017-01-22）

國家自然科學基金資助項目（81373814）；北京中醫藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設

項目（2012-SZ-C-42）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目（CIT＆TCD201504097）

△通信作者（電子郵箱：liurenhui995@163.com）