中藥聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法對艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響?

鄒 雯，王 健△，劉 穎，咸慶飛，張復(fù)春

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；2.廣州市第八人民醫(yī)院，廣州 510060)

?

【臨床基礎(chǔ)】

中藥聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法對艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響?

鄒 雯1，王 健1△，劉 穎1，咸慶飛1，張復(fù)春2

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；2.廣州市第八人民醫(yī)院，廣州 510060)

目的：觀察中藥免疫2號顆粒聯(lián)合HAART療法對44例艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響，初步探索該療法對機體免疫調(diào)節(jié)的作用機制。方法：隨機雙盲安慰劑對照研究，治療組23例采用HAART+免疫2號顆粒，對照組21例采用HAART+免疫2號顆粒模擬劑，觀察時間1年。觀察指標包括CD4+T淋巴細胞計數(shù)、IL-2mRNA、IL-10mRNA。結(jié)果：試驗組CD4+T淋巴細胞計數(shù)上升顯著優(yōu)于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；試驗組IL-2上升，ΔCt增加值試驗組上升幅度明顯優(yōu)于對照組，2組療后-療前差值比較有統(tǒng)計學(xué)意義；試驗組和對照組IL-10ΔCt值均上升，2組療后-療前差值比較無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：中藥免疫2號顆粒聯(lián)合HAART治療可較對照組明顯上調(diào)艾滋病免疫重建不全患者IL-2的表達，還需擴大樣本量進一步驗證。

中醫(yī)藥；免疫重建不全；IL-2；IL-10

免疫功能重建不全是艾滋病治療領(lǐng)域的難點和瓶頸問題，約30%左右的患者在保證良好依從性的前提下接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)療法后，即使血漿病毒載量較長時間控制在檢測不出的水平之下，其CD4+T淋巴細胞數(shù)量始終在基線水平或低于200～350 cells/mm3[1]。中藥聯(lián)合HAART能夠有效調(diào)節(jié)患者免疫功能，促進免疫重建，然而其作用機制尚不明確。

文獻研究顯示，IL-2(Interleukin-2)、IL-10(Interleukin-10)等細胞因子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡方面具有重要作用[2-5]。本研究采用隨機雙盲安慰劑對照方法研究中藥免疫2號顆粒聯(lián)合HAART對44例艾滋病免疫重建不全患者IL-2、IL-10等細胞因子的影響，探索該療法對機體免疫調(diào)節(jié)的作用機制。

1 資料

1.1 一般資料

選取2014年2月至2015年5月廣州市第八人民醫(yī)院44例免疫重建不全患者，患者均參加中國中醫(yī)科學(xué)院臨床評價中心中央隨機系統(tǒng)分組。其中治療組23例，對照組21例。治療組年齡(41.62±9.8)歲，身高(164.83±6.52) cm，體質(zhì)量(55.45±8.7) kg，CD4基線值(201.67±62.36)cells/ul；對照組年齡(41.53±9.89)歲，身高(164.11±6.52) cm，體質(zhì)量(57.8±8.6) kg，CD4基線值(193.1±67.54)cells/ul。2組年齡、體質(zhì)量、體溫、心率、呼吸、血壓癥狀體征基線比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 納入標準

艾滋病診斷標準參照《艾滋病診療指南》[6]。接受HAART治療大于12個月且小于24個月的患者CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)<200 cells/ul，接受HAART治療大于24個月的患者CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)<350 cells/ul，HIV RNA低于檢測值；入組時CD4+絕對計數(shù)≥50 cells/ul；年齡18～70歲；自愿參加本研究并簽署知情同意書。

1.3 排除標準

入組前嚴重的機會性感染未得到控制者；入組前1個月內(nèi)或正在參加其他藥物臨床試驗的患者；入組前1個月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)治療者；有自身免疫性疾病患者；妊娠或哺乳期婦女或準備妊娠婦女；任何有腎功能不全癥狀患者；存在智力或語言障礙，不能充分理解試驗內(nèi)容或給予良好合作的患者。

2 方法

2.1 治療用藥

治療組采用 HAART(藥物組合為AZT/TDF+3TC+EFV/NVP)+免疫2號顆粒(黃芪24g，黨參18 g，靈芝18 g，枸杞子18 g等藥物組成)，規(guī)格：5.5 g/袋，溫水沖服，每日2次，每次1袋，與抗病毒西藥間隔1 h以上。顆粒劑由江陰天江制藥有限公司提供(批號1311327)；對照組采用 HAART(藥物組合為AZT/TDF+3TC+EFV/NVP)+免疫2號顆粒模擬劑。模擬劑由上述廠家自行設(shè)計生產(chǎn)最終由非試驗參與人員統(tǒng)一包裝，模擬劑在外形、包裝、顏色、氣味上與原藥一致。用藥療程為1年。

2.2 觀察指標及方法

抽取患者5ml靜脈血EDTA-K2抗凝，用Trizol LS提取全血中總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測IL-2及IL-10 mRNA水平，CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)采用流式細胞術(shù)，以上均委托廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司進行檢測。數(shù)據(jù)處理采用ΔCT方法計算靶基因的相對表達水平：先計算每組中每個基因3個復(fù)孔的平均Ct值，ΔCt=平均Ct值(靶基因)-Ct(β-actin)，療前療后各檢測1次。

2.3 主要儀器與試劑

RNA提取TRIZOL LS REAGENT(Invitrogen，貨號10296010)；逆轉(zhuǎn)錄MLV REVERSE TRANSCRIPTASE(Invitrogen，貨號28025013)、RNASEOUT RECOMB(Invitroge，貨號10777019)；擴增 Faststart Universal SYBR(Roche，貨號4913914001-1)，所用PCR儀器 Bio-Rad(型號CFX-96)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

表1顯示， 治療12個月后，2組CD4+T淋巴細胞計數(shù)均上升，試驗組上升顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。試驗組和對照組IL-2 mRNA ΔCt值均上升，試驗組上升幅度明顯優(yōu)于對照組，2組療后-療前差值比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；試驗組和對照組IL-10 mRNA ΔCt值均上升，但2組療后-療前差值比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組CD4+T淋巴細胞計數(shù)及外周血中IL-2、IL-10 mRNA水平ΔCT值前后比較

注：與對照組治療后比較：*P<0.05

4 討論

HIV進入人體后，CD4+T淋巴細胞被大量吞噬、破壞，成為人體免疫系統(tǒng)中最主要的攻擊目標。CD4輔助T細胞(Th)可分泌Th1和Th2等不同細胞因子，其中IL-2由Th1產(chǎn)生，具有增強吞噬細胞、NK細胞及細胞毒T淋巴細胞活性，促進細胞免疫的作用，是參與免疫應(yīng)答的重要細胞因子，與其他細胞因子有協(xié)同和拮抗作用，共同完成機體免疫機能的平衡調(diào)節(jié)。IL-10是一種多功能負性調(diào)節(jié)因子，主要由Th2細胞、活化的B細胞、單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，參與免疫細胞、炎癥細胞、腫瘤細胞等多種細胞的生物調(diào)節(jié)。有研究顯示，免疫重建不全患者的IL-2水平較免疫重建良好的患者明顯降低[7]；另外IL-2作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，與HAART療法聯(lián)合應(yīng)用可比單用HAART療法更有效提升CD4細胞計數(shù)[8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，免疫調(diào)節(jié)指機體通過多方面、多層次的正負反饋機制控制免疫應(yīng)答的強度和時限，以維持機體生理功能的平衡與穩(wěn)定。其方法包括通過免疫增強劑或免疫抑制劑對機體神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫細胞之間以及免疫細胞與各種體液因子之間進行整體調(diào)節(jié)。而且免疫學(xué)認為人體是一個統(tǒng)一的整體，要保持人體的健康，就必須保持免疫系統(tǒng)處于相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。這種認識與中醫(yī)的整體觀念以及治療上的扶正祛邪、調(diào)整陰陽頗為相似。因此IL-2、IL-10 mRNA水平研究對于探索中醫(yī)藥治療艾滋病的療效作用機制具有一定的價值。

IL- 2被發(fā)現(xiàn)迄今已有30余年，但仍然是最受關(guān)注和被廣泛研究的細胞因子之一。其主要功能不僅是提升免疫反應(yīng)，更重要的是維持Treg細胞的穩(wěn)定及其介導(dǎo)的免疫耐受，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[9]。既往 IL-2 多應(yīng)用于提高抗腫瘤免疫研究[10-11]，在中醫(yī)藥治療艾滋病方面研究較少。中藥免疫2號顆粒由黃芪、黨參、靈芝、枸杞子等藥物組成，具有扶正固本的功效。本研究用中藥免疫2號顆粒聯(lián)合HAART干預(yù)12個月后分析結(jié)果顯示，試驗組CD4+T淋巴細胞計數(shù)上升明顯優(yōu)于對照組，試驗組與對照組IL-2均上升，ΔCt增加值試驗組上升幅度明顯優(yōu)于對照組，2組療后-療前差值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而試驗組與對照組IL-10均上升，ΔCt增加值2組療后-療前差值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明IL-2可能是一個有潛力且比較敏感的反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)能力的指標，其與反映艾滋病患者免疫系統(tǒng)重建國際公認的金指標CD4+T淋巴細胞計數(shù)之間的關(guān)系還有待進一步擴大樣本量深入研究。

[1] NEGREDO E, MASSANELLA M, PUIG J, et al. Nadir CD4 T cellcount as predictor and high CD4 T cell intrinsic apoptosis as final mechanism of poor CD4 T cell recovery in virologically suppressed HIV infected patients: clinical implications[J]. Clinical Infectious Disease, 2010,50 (9):1300-1308.

[2] BARTHLOTT T, MONCRIEFFE H, VELDHOEN M,et al. CD25+CD4+T cells compete with naive CD4+T cells for IL-2 and exploit it for the induction of IL-10 production[J].International immunology,2005,17 (3):279-288.

[3] CARCELAIN G, SAINT-MEZARD P, ALTES H K, et al. IL-2 therapy and thymic production of naive CD4 T cells in HIV-infected patients with severe CD4 lymphopenia[J].AIDS,2003,17(6):841-850.

[4] SABBATINI F, BANDERA A, FERRARIO G, et al. Qualitative immune modulation by interleukin-2 (IL-2) adjuvant therapy in immunological non responder HIV-infected patients[J].PLoS ONE, 2010,5(11):14119.

[5] MARCHETTI G, MERONI L, VARCHETTA S, et al. Low-dose prolonged intermittent interleukin-2 adjuvant therapy: results of a randomized trial among human immunodeficiency virus-positive patients with advanced immune impairment [J]. Journal of Infectious Diseases, 2002, 186(5): 606-616.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會艾滋病學(xué)組.艾滋病診療指南[J].中華傳染病雜志,2005,24(2):133-144.

[7] ERIKSTRUP C, KRONBORG G, LOHSE N, et al. T-cell dysfunction in HIV-1-infected patients with impaired recovery of CD4 cells despite suppression of viral replication[J].Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 2010, 53(3): 303-310.

[8] PETT S L, KELLEHER A D, EMERY S. Role of interleukin-2 in patients with HIV infection [J].Drugs, 2010, 70 (9): 1115-1130.

[9] 翟志敏.IL-2 對免疫激活和免疫耐受的雙向調(diào)節(jié)作用[J].中國藥理學(xué)通報,2013,29(3) :319-322.

[10] AHMADZADEH M， ROSENBERG S A．IL- 2 administration increasesCD+4 CD25hiFoxp3+ regulatory T cells in cancer patients [J] Blood,2006,107( 6):2409-2414.

[11] LEMOINE F M，CHERAI M，GIVERNE C，et al．Massive expansion of regulatory T-cells following interleukin 2 treatment during a phaseⅠ-Ⅱdendritic cell-based immunotherapy of metastatic renal cancer [J]. International Journal of Oncology,2009,35 (3):569-581.

Effects of Immune 2 Granule Combined with HAART Therapy treatment on IL-2 and IL-10 mRNA level of HIV/AIDS with Incomplete Immune Recovery

ZOU Wen1, WANG Jian1△, LIU Ying1, XIAN Qing-fei1, ZHANG Fu-chun2

(1.TCMCenterforAIDSPreventionandTreatment,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;2.GuangzhouEighthPeople’sHospital,Guangzhou510060,China)

Objective:To assess the therapeutic effect of Immune 2 granule on IL-2 and IL-10 mRNA level of HIV/AIDS patients with incomplete immune recovery after highly active antiretroviral therapy (HAART) for 12 months, to explore the mechanism of immune regulation.Methods:Randomized, double-blind, placebo-controlled study was adopted, 23 cases of treatment group was treated with HAART+ Immune 2 granule, 21 cases were treated with HAART+ placebo, treatment period lasted for 12 months with the observation parameters such as. CD4+Tlymphocyte count, IL-2 and IL-10.Results: The CD4+cell count of treatment group increased significantly compared with the control group, the difference is statistically significant between groups; IL-2 increased in treatment group, ΔCt increased more than the control group, significant statistical differences was found between groups; IL-10 increased in treatment group, ΔCt increased by 0.51±3.2, the control group increased by 1.24±4.37, no significant statistical differences was found between groups. Conclusion: Chinese medicine immune 2 granule with HAART therapy can increase the expression of IL-2 mRNA level in HIV/AIDS patients with incomplete immune recovery. The mechanism of TCM intervention to promote immune regulation was shown. But it still needs to enlarge the sample size to get more evidences.

Traditional Chinese medicine; Incomplete Immune Recovery; IL-2; IL-10

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81503571)-從T細胞免疫活化分子及Toll樣受體信號通路探究中醫(yī)藥治療HAART后免疫無應(yīng)答患者的免疫調(diào)節(jié)機制；中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所自主選題項目(YZ-1662)

鄒 雯(1982-)，女，湖南人，助理研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事艾滋病的中醫(yī)臨床與研究。

△通訊作者：王 健，E-mail:62tiger@163.com。

R512.91

B

1006-3250(2017)06-0824-02

2016-12-17