方氏頭針對血管性癡呆大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達的影響

田文靜，王瑞輝，黃琳娜，安軍明

(1.成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610000；陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046;3.西安市中醫醫院針灸推拿科，西安 710001)

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【針灸研究】

方氏頭針對血管性癡呆大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達的影響

田文靜1，王瑞輝2，黃琳娜3，安軍明3

(1.成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610000；陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046;3.西安市中醫醫院針灸推拿科，西安 710001)

目的： 觀察各組大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達的變化，探討方氏頭針治療VD的作用機理。方法：將40只健康大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和頭針組4組各10只，通過改良的4-VO法制備VD模型，隨后頭針組進行選穴針刺，余3組正常喂養，10 d后采用Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力的變化，ELLSA檢測大鼠海馬區TNF-α表達的變化。結果:與正常組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期及首次跨越原象限平臺的時間均有明顯延長，海馬組織中TNF-α表達也明顯升高，而經頭皮針治療后，大鼠的平均逃避潛伏期及首次跨越原象限平臺的時間明顯縮短，TNF-α表達明顯降低，正常組與假手術組比較差異無統計學意義。結論：方氏頭針可以有效改善VD大鼠的學習記憶能力，這可能與方氏頭皮針可以調控大鼠海馬組織中TNF-α的表達有關。

方氏頭皮針；血管性癡呆；炎性因子；TNF-α

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康合格SD大鼠40只，體質量(280±20) g，購于第四軍醫大學動物實驗中心(合格證號scxk-(軍)2012-0007)。SPF級鼠房適應性飼養1周后，將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、頭針組，每組各10只，保證所有大鼠在實驗過程中自由攝食和飲水(術前禁食除外)。

1.2 主要儀器與藥品

SDQ-30雙極射頻電凝器，(上海手術器械廠)，Morris水迷宮(陜西中醫學院針灸推拿系基礎實驗室提供)，大鼠TNF-αELLSA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 VD模型制備

VD模型根據改良后的Pulsinelli，s4-VO法進行制備[6]：手術前大鼠禁食12 h，禁水6 h稱重，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 ml/100 g)后，將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，行背側枕部正中切口，暴露出第一頸椎兩側橫突板上的翼小孔，用直徑為0.5 mm的電凝針電凝兩側翼小孔內的椎動脈，致使兩側椎動脈造成永久性閉塞，縫合待大鼠清醒后送回動物房飼養，期間禁食。24 h后再次將大鼠麻醉，仰臥位固定行腹側頸正中切口，暴露出兩側的頸總動脈，“4”號線掛線，用微動脈夾同時夾閉雙側頸總動脈各5 min，反復3次，每次間隔1 h，期間用紅外燈照射維持大鼠體溫在37℃左右，縫合待大鼠清醒后送回動物房內飼養。術后每只大鼠每日給予8萬單位青霉素鈉皮下注射預防感染。假手術組大鼠除不電凝雙側椎動脈、不夾閉雙側頸總動脈外，余處理皆同模型組，正常組大鼠不做任何處理。

1.4 術后觀察

術后1周手術組大鼠的死亡率為15%，均為術后感染而死，另有1只因術后肢體偏癱不能做劃水動作而棄用。

本文基于多源數據，采用假設檢驗方法實證研究了我國兩化融合績效情況，并探索性地分析了兩化融合在加強企業價值創造能力、推動行業綜合發展、提升經濟發展質量等方面績效產生的機理，得出以下3點結論：

1.5 治療

術后10 d，根據方云鵬主編的《頭皮針》[7]選穴方法選穴。倒臟上焦：中央溝在頭皮表面的投影向后1.5 cm的平行線，即為中央后回在頭皮表面的投影(即倒臟穴區，其橫向寬度為中央溝與中央后回之間的區域，縱向長度從眉頂枕線向左右兩側旁開1 cm開始計算，平均為9 cm)，倒臟穴區分為上焦、中焦、下焦三部分，其中央后回下部4 cm的區域即為倒臟上焦穴區；記憶穴：以頂枕點、矢狀縫與人字縫的交匯點為中心點，分別向左右前下方，與頂枕線呈30°夾角劃兩條直線，在這兩條直線上，與中心點相距7 cm處即為記憶穴；思維穴：左右兩額骨隆凸之間，即由眉間棘直上3 cm處； 大鼠比擬人體取穴方法取穴。

穴位常規消毒后，選用0.4 mm×13 mm的無菌華佗牌針灸針，采用“飛刺”的方法將針快速深刺至頭骨骨膜(以右手拇指、食指、中指夾持針柄，保持針體平直，利用肘部帶動腕部的力量，將針快速垂直刺入，穿透頭皮直達顱骨骨膜，留針30 min)，每日針刺1次，連續治療10 d。

1.6 水迷宮實驗

1.6.1 定位航行試驗 首先對所有大鼠進行為期2 d的學習訓練，訓練時將大鼠分別從不同入水點放入水中，以大鼠在2 min內尋找到平臺所在位置并爬上平臺停留10 s為訓練成功。從第3天開始正式實驗，每天4次，每次分別從A、B、C、D 4個不同象限的入水點將大鼠放入水中，記錄大鼠在2 min內游到平臺所在位置并爬上平臺的時間，2 min內未爬上平臺的大鼠逃避潛伏時間按2 min記錄。

1.6.2 空間探索實驗 5 d的定位航行實驗結束后，第6天撤去平臺，分別將大鼠從A、B、C、D 4個不同象限入水點放入水中，記錄大鼠在2 min內第1次游過原平臺所在位置的時間以及2 min內游過原平臺所在位置的次數。

1.7 ELLSA法檢測

水迷宮實驗結束后將大鼠斷頭取腦，然后在冰臺上迅速剝離兩側的海馬組織，將海馬組織按2.5 ml/g 腦質量加入相當體積的冰生理鹽水，在冰浴中用勻漿器將海馬組織充分研磨隨后超聲波粉碎，進一步將海馬組織進行破碎，10000 r/min 4℃ 離心10 min取上清液。隨后嚴格按照TNF-α ELISA 法說明書步驟進行，在酶標儀上讀取各孔的OD值，測量波長為450 nm。

2 統計學方法

3 結果

3.1 水迷宮檢測結果

表1顯示，在為期2 d的定位航行訓練中，各組大鼠的逃避潛伏時間均有較大的波動，如正常組大鼠在第1天、第2天的平均逃避時間分別為(44.54±3.18)、(30.54±1.65)。而經過2 d的學習訓練后，大鼠的逃避潛伏時間趨于穩定，隨后3 d的定位航行試驗中，大鼠的逃避潛伏時間分別為(25.86±3.48)、(23.04±3.35)、(22.11±1.84)。因此，為保證數據的穩定性，剔除前2 d的數據，以第3、4、5天的記錄數據進行統計分析。結果顯示，模型組大鼠在后3 d定位航性試驗中的平均逃避潛伏時間比正常組大鼠有明顯延長(P<0.01)，提示全腦缺血發生后，大鼠的學習能力出現衰退，說明癡呆模型制備成功。而與模型組大鼠在后3 d的平均逃避潛伏時間比較，頭針組大鼠的逃避潛伏時間明顯縮短(P<0.01)，提示方氏頭皮針的干預可以有效提高VD大鼠的學習能力。正常組與假手術組比較，二者的平均逃避潛伏時間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1顯示，在第6天的空間探索實驗中，撤去平臺后，通過記錄大鼠第一次游過原平臺所在位置的時間以及2 min內游過原平臺所在位置的次數來檢測大鼠空間記憶能力的變化。結果顯示，模型組大鼠第一次游過原平臺所在位置所需時間比正常組大鼠明顯延長(P<0.01)，游過原平臺所在位置的次數也明顯少于正常組(P<0.01)。提示全腦缺血發生后，大鼠的空間記憶能力也出現了明顯的衰退。而與模型組大鼠比較，頭針組大鼠第一次游過原平臺所在位置所需時間有明顯縮短，游過次數也明顯增多(P<0.01)，提示方氏頭皮針干預可以有效改善VD大鼠的空間記憶能力。正常組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3.2 ELLSA法檢測結果

表1顯示，各組大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達的檢測結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬組織中TNF-α的表達明顯升高(P<0.05)。而頭針干預治療后，大鼠海馬組織中TNF-α表達明顯降低(P<0.05)。正常組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮及ELLSA法檢測結果比較

注：與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

4 討論

方氏頭針是方云鵬老教授在傳統經絡學說基礎上結合現代大腦皮層定位理論所研發的新的針灸療法。傳統經絡學說認為[8]，針刺穴位(頭穴)后產生的針感反應具有沿循經絡的一定路線向軀干、四肢傳導的能力，即針刺的循經感傳現象。方云鵬根據現代生理學分析認為，針刺的這種循經感傳效應并非是體表局部存在此種傳導興奮的機能線，而是神經中樞(可能是大腦皮質)在機能排列在一起特殊的皮層上發生興奮的結果，并認為經絡就是中樞神經系統內特殊機能排列在人體局部的投射，人體上任何一點受到刺激都可以在中樞發生一個興奮點，在中樞上存在著一些機能上相互關聯的細胞，由此而解釋了針刺穴位(頭穴)能夠引起一條感應路線的原因，從而總結性地認為神經是經絡的本質，經絡是神經功能活動的現象。

方云鵬經過長期臨床實踐的不斷探索和總結，結合現代的大腦皮層功能定位學說，創新性地提出了“大腦功能體表投影理論”，根據大腦皮層的不同功能定位在頭皮表面的投影將頭部穴位分為伏臟(2區)、伏像(1區)、倒臟(2區)、倒像(2區)等7個中樞刺激區和記憶、思維、說話、運平、信號、聽覺、書寫、視覺、嗅味、平衡、呼循(除思維是一穴外，其余均為2穴)等22個皮質功能刺激點，由此極大地豐富和發展了頭皮針的理論體系。本實驗中，筆者根據方云鵬主編《頭皮針》的相關論述進行選穴，選擇“倒臟上焦”“思維穴”“記憶穴”等。 “倒臟上焦”是頂葉中央后回的下部在頭皮表面的投影，“記憶穴”是頂葉的角回在頭皮表面的投影，“思維穴”則是額葉前部在體表的投影。研究表明[9-12]，中樞神經系統中空間記憶的產生主要是頂葉和前額葉的協同作用，其中頂葉是空間信息加工的重要腦區，而前額葉則在記憶執行過程中起重要作用。

VD是一類臨床病理表型和病理生理機制多樣的綜合征，其所致的認知受損來源于多種形式的血管性病變，如出血性卒中、缺血性卒中及慢性缺血缺氧等，其中缺血性損傷是導致VD發病最常見的因素。目前VD的發病機理尚未完全闡明，可能的機制包括膽堿能通路受損、Ca2+代謝失調、缺血性損傷后炎癥反應導致的遲發性腦損傷等。其中缺血性損傷后的炎癥反應一直是VD發病過程中研究的熱點。在VD發病過程中，無論是腦卒中還是慢性缺血的過程，都少不了炎癥介質的參與。以往的實驗研究發現，IL-6、TNF-α、IL-1β、C-反應蛋白等炎癥介質與癡呆所致的認知功能缺損緊密相關[13-15]。最新的病理學研究也發現，在VD認知障礙患者的損傷白質中，炎癥標志物(如細胞因子和黏附分子)明顯增加[16]。筆者通過觀察各組大鼠海馬組織中炎性介質TNF-α的表達變化也得到了一致的結果，并通過方氏頭針的干預驗證了其頭針能明顯改善VD大鼠的認知功能障礙，這與以往我們臨床的研究發現一致。以往臨床研究發現，方氏頭針在改善VD患者認知障礙方面有著非常顯著的療效[17-18]。結合本實驗結果，提示在VD的早期治療中，采用方氏頭針控制甚至逆轉其認知功能缺損癥狀是可行的策略，并進一步揭示方氏頭針改善VD患者認知障礙的機制可能與調控腦缺血損傷后海馬組織中炎性介質TNF-α的表達，從而抑制腦缺血損傷后的炎性反應有關，由此為臨床應用和推廣方氏頭針治療血管性癡呆提供了可靠的實驗依據。

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Effects of Scalp Acupuncture on the Expression of TNF-α in Hippocampal Region of Rats with Vascular Dementia

TIAN Wen-jing1，WANG Rui-hui2，HUANG Lin-na3，AN Jun-ming3

(1.Departmentofacupuncture,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610000,China;2.TraditionalChineseMedicalUniversityofShanxi,Xianyang710012,China;3.DepartmentofacupunctureofXianHospitalofTraditionalChineseMedical,Xian710001,China)

Objectives: This study was intended to observe the effect of scalp acupuncture on the expression of TNF-α in the hippocampal region and explore how to improve vascular dementia with Fang’s scalp acupuncture. Methods: Forty male rats were arbitrarily put into four groups each with 10 rats: normal group, mock group, model group and Fang’s scalp acupuncture group. We used a revised Pulsinelli 4-vessel-occlusion technique to build a vascular dementia model and performed acupuncture on the points of “Si Wei”, “Dao Zang Shang Jiao”, and “Ji Yi”. Acupuncture was applied on those points in the rats for 30 minutes per day. With the Morris water maze, the rats were examined for their capability in learning and memorizing. The enzyme linked immunosorbent assay was used to measure the expression of TNF-α in the hippocampal region. Results: It was found that the expression of TNF-α in the model group was significantly higher than that in the mock and normal groups.It was also seen that the increase in TNF-α was effectively suppressed in the scalp acupuncture group, resulting in the improvement in the memorizing and learning capabilities of the rats. Conclusions: This study indicated that the Fang’s scalp acupuncture was an effective way to treat the vascular dementia of rats by blocking the expression of TNF-α in the hippocampal region, leading to the improvement in their ability in learning and memorizing.

Fang’s scalp acupuncture；Vascular dementia；Inflammatory cytokines； TNF-α

田文靜(1984-)，女，醫學博士，從事針灸治療腦源性疾病的臨床與實驗研究。

R245.32+1

B

1006-3250(2017)06-0833-04

2016-12-16