天芪益智顆粒對阿爾茨海默病模型大鼠炎性反應的保護作用

張佳佳 孟繁興 馬濤 王樂 陳志剛 陳路 劉一川

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天芪益智顆粒對阿爾茨海默病模型大鼠炎性反應的保護作用

張佳佳 孟繁興 馬濤 王樂 陳志剛 陳路 劉一川

目的 研究中藥治療AD相關機制，探究以益氣活血法為組方原則的天芪益智顆粒對AD大鼠腦組織炎性反應的保護作用。方法 90只雄性SD大鼠隨機分成6組，每組15只，模型組和治療組予Aβ1-42在大鼠側腦室注射建立AD動物模型，造模成功后，治療組分別灌服濃度為高、中、低劑量的天芪益智顆粒每天一次，對照組灌服石杉堿甲每天一次，空白組和模型組予等量生理鹽水每天一次，給藥體積均為20 mL/kg體重，分別連續給藥30天。喂養30天以后取大鼠腦組織進行蛋白提取，用western blot方法觀察各組大鼠腦組織相關蛋白的表達。結果 (1)模型組較空白組GFAP和Iba-1的表達顯著增高(P<0.05); (2)天芪益智顆粒和石杉堿甲可使大鼠腦組織GFAP和Iba-1的表達量顯著降低(P<0.05);(3)天芪益智顆粒和石杉堿甲使phospho-p38/t-p38的表達量明顯降低(P<0.05);(4)天芪益智顆粒使AD大鼠腦iNOS、COX-2表達量顯著降低(P<0.05)。結論 (1)Aβ1-42側腦室注射可以模擬AD炎性反應機制；(2)天芪益智顆粒通過抑制腦組織膠質細胞的激活、降低phospho-p38/t-p38表達及p38-NF-κB信號通路激活、抑制促炎因子COX-2、iNOS的表達對AD大鼠炎性反應具有保護作用。

阿爾茨海默病； 天芪益智顆粒； 實驗研究； 炎性反應

阿爾茨海默病是老年人中常見的神經系統退行性疾病，全世界大約有3600萬人患有AD，中國60歲以上人群中阿爾茨海默病的患病率為3%～5%，并且逐年上升，據世界衛生組織推算，到21世紀中葉AD將成為中國疾病負擔排名第四位的疾病[1]，對AD的預防及治療是一項重大的課題。

中醫藥對阿爾茲海默病的預防及治療有一定的意義。已知AD發病是與年齡密切相關的，有流行病學調查顯示年齡每增加5歲，癡呆的發病率會增加一倍，在中國80歲以上的老年人的發病率高達20%,中醫素有“久病必瘀”“老人多瘀”“虛久致瘀”的說法。五臟虛衰與瘀血的產生有相互作用關系，因虛可以致瘀，而瘀久則使虛更甚。現研究者多將AD的治療窗前移，1999年國外學者首次提出輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)診斷標準，MCI的發病與AD的關系受到重視，在國外的研究中指出MCI患者發展為AD的概率比正常人高10倍，平均每年有12%的MCI患者發展為AD[2]。國內臨床研究提示氣虛血瘀是MCI的主要病機[3-4]。

天芪益智顆粒是王永炎教授從癡呆病機出發創制的，由君藥紅芪18 g、臣藥紅景天6 g配伍組成，具有益氣活血通絡的作用，治療癡呆屬氣虛血瘀、腦脈痹阻型。藥理研究表明紅芪具有抗衰老、調節免疫、抗氧化應激、抑制炎癥反應等作用；紅景天可增強神經細胞功能、提高記憶力、改善認知行為等。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性4月齡SD大鼠90只，購自中國食品藥品監定研究院(許可證號:SCXK(京)2014-0013)，體重190～220 g。SPF級環境飼養，溫度(24±2)℃，相對濕度(50±10)%，大鼠自由飲食，明暗交替12小時。大鼠以隨機數字表法分治療組、陽性對照組、假手術組、模型組，其中治療組分天芪益智顆粒藥液高、中、低劑量3組，每組15只。

1.2 動物造模

將1 mg Aβ1-42溶于無菌0.9%生理鹽水至濃度為10 μg/mL，4℃孵育24小時，用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，手術區消毒，在顱頂中間部作一縱切口，暴露顱骨，在前鹵向右旁開1.4 mm、向后1.4 mm處用顱骨鉆鉆開顱骨，垂直插入微量進樣器進針4 mm，將1 μL Aβ1-42以1 μL/min的速度緩慢地注入大鼠側腦室，留針3分鐘以保證溶液充分彌散，隨后緩慢撤針。皮膚切開處用慶大霉素點滴，縫合切口。假手術組注入等體積生理鹽水，其他操作同上。

1.3 實驗用藥

天芪益智顆粒的組成包括君藥紅芪和臣藥紅景天，由北京中醫藥大學中藥學院提供，批號：20140913。將天芪益智顆粒藥液稀釋成214 g/mL、107 g/mL、53.4 g/mL三個濃度。陽性對照藥為石杉堿甲片(哈伯因)，河南太龍藥業股份有限公司生產，批號140910A，采用無菌生理鹽水配制成0.004 mg/mL溶液。

1.4 主要試劑及儀器

Aβ1-42(杭州中肽生化有限公司)、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)、多克隆抗體β-actin(美國Santa Cruz公司)。低溫高速離心機(Eppendorf公司)、電泳儀(Bio-rad公司)、電熱恒溫水箱(北京長安科學儀器廠)、凝膠成像儀(Gene公司)。

1.5 Western blot

取適量大鼠腦組織，加預冷的RIPA裂解液(100 mg加1 mL RIPA裂解液)，在冰上于勻漿器中充分研磨，放置5分鐘，4℃、12000 r/min離心15分鐘，取上清液，測定蛋白含量，電泳，轉膜，封閉，加一抗、二抗孵育后，用ECL發光法采集圖像，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 天芪益智顆粒對AD大鼠腦組織膠質細胞激活的影響

腦組織中炎性反應主要由激活的膠質細胞啟動，GFAP和Iba-1分別是星形膠質細胞和小膠質細胞的特異性標示蛋白。如圖1、表1所示，與假手術組相比，AD模型大鼠腦組織GFAP和Iba-1表達顯著升高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，天芪益智顆粒高、中、低劑量組和石杉堿甲組大鼠腦組織GFAP和Iba-1的表達量顯著降低(P<0.05)。其中高、中、低劑量的天芪益智顆粒和石杉堿甲可分別使GFAP表達量降低65.12%、58.39%3、5.15%和62.18%，使Iba-1表達量降低71.63%、54.44%、50.58%和13.02%。該結果表明天芪益智顆粒可明顯抑制AD模型大鼠腦組織膠質細胞的激活。

注： A.假手術組; B.模型組;C.陽性藥組;D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖1 膠質細胞GFAB、Iba-1的激活

表1 天芪益智顆粒對AD大鼠腦組織膠質細胞GFAB、Iba-1激活的影響(與假手術組百分比值，n=5)

注： 與模型組相比，藥物組Iba-1和GFAP的表達量均降低(P<0.05)。

2.2 天芪益智顆粒對AD大鼠腦p38-NF-κB信號通路激活的影響

如圖2、3和表2所示，與假手術組相比，模型組AD大鼠腦組織p38蛋白磷酸化占總蛋白的比值p-p38/t-p38和p65堿性磷酸化占總蛋白的比值NF-κB phospho-p65/NF-κB p65顯著升高(P<0.05)，表明p38-NF-κB信號通路被激活。與模型組相比，天芪益智顆粒和石杉堿甲可明顯降低phospho-p38/t-p38的表達量(P<0.05)，與模型組相比，高、中、低劑量天芪益智顆粒及石杉堿甲可分別使phospho-p38/t-p38降低56.17%、38.83%、30.51%和59.66%。天芪益智顆粒高、中、低劑量分別使NF-κB phospho-p65/NF-κB p65降低58.88%、41.29%和17.13%，而石杉堿甲則對NF-κB激活沒有顯著影響，結果顯示天芪益智顆粒對AD大鼠腦內p38-NF-κB信號通路激活具有顯著的抑制作用。

注： A.假手術組; B.模型組;C.陽性藥組;D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖2 p38堿性磷酸化程度

注： A.假手術組; B.模型組;C.陽性藥組; D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖3 NF-κB亞基p65磷酸化的程度

表2 天芪益智顆粒對AD大鼠p-38磷酸化、NF-κB亞基p65磷酸化的影響(與假手術組百分比值)

注： 藥物組與模型組對比，p38堿性磷酸化、NF-κB亞基p65磷酸化的程度減低(P<0.05)。

2.3 天芪益智顆粒對促炎性因子iNOS、COX-2表達的影響

如圖4、表3所示，與假手術組相比，模型大鼠腦組織內iNOS、COX-2表達量顯著升高(P<0.05)，與模型組大鼠相比，天芪益智顆粒可使AD大鼠腦iNOS、COX-2表達量顯著降低(P<0.05)。高、中、低劑量天芪益智顆粒和石杉堿甲可分別使iNOS表達量降低92.30%、72.85%、40.95%和21.32%，使COX-2表達量降低84.19%，75.30%和48.64%和51.64%。結果提示天芪益智顆粒對AD大鼠腦內促炎性因子iNOS、COX-2的表達具有顯著的抑制作用。

注： A.假手術組; B.模型組;C.陽性藥組; D.天芪益智顆粒高劑量組;E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖4 炎性因子iNOS、COX-2的表達

表3 天芪益智顆粒對AD大鼠iNOS、COX-2表達的影響(與假手術組百分比值,n=15)

3 討論

McGeer PL等[5]根據其研究結果提出抗炎治療或許可以治療AD，他在1996年發表文章稱其根據對不同地區不同國家進行流行病學研究得出風濕性關節炎患者經長期抗炎治療后，AD的患病率較未經抗炎治療顯著降低，因此他認為抗炎治療或許可以治療AD。此后，多項研究認為炎癥反應是AD發病的重要因素，證據提示，神經炎性反應是AD發病的驅動因素[6-7]。本實驗證實益氣活血方天芪益智顆粒及石杉堿甲對AD模型大鼠炎癥反應具有保護作用。益氣活血方天芪益智顆粒可以通過抑制腦組織膠質細胞的激活、抑制p38-NF-κB信號通路激活、抑制促炎因子COX-2、iNOS的表達對AD大鼠炎性反應起到保護作用，其保護作用與藥物劑量呈正相關，提示采用益氣活血治法在AD早期干預對于AD防治的重要臨床意義。

實驗研究應當為臨床應用服務，目前臨床常用于治療AD的藥物長期療效不確切，不良反應較多，且藥價昂貴，患者依從性較差，中藥具有價格便宜、不良反應較小等優點，因此研究中藥對AD對的治療有重要的意義。本實驗為后續臨床研究用益氣活血法治療AD提供了理論基礎，其保護機制有待進一步研究，臨床上可進行多中心隨機對照研究，進一步評價益氣活血法治療AD的臨床有效性及安全性。

[1] 陳新平. 阿爾茨海默病病因學及發病機制研究進展[J].中國現代神經疾病雜志，2005，5(3)：152-155.

[2] 賈建平. 重視輕度認知障礙與老年性癡呆關系的研究[J].中華神經科雜志，2002，35(6)：324-326.

[3] 鄭衛莉，張杜平，劉瑩. 益氣活血法治療輕度認知功能障礙的臨床研究[J].新疆中醫藥，2008，5(3)：5-7.

[4] 謝麗英，陳朝俊.補陽還五湯聯合多奈哌齊治療輕度認知功能障礙30例[J].江西中醫藥，2015，(4)：26-28.

[5] McGeer PL，Schulzer M，McGeer EG. Arthritis and anti-inflammatory agents as possible protective factors for Alzheimer's disease：a review of 17 epidemiologic studies[J].Neurology，1996，47(2)：425-432.

[6] 李慧源，姜源，孫曉紅. 阿爾茨海默病炎性反應機制的研究進展[J].中國臨床研究，2016，29(1)：130-132.

[7] Cagnin A，Myers R，Gunn RN，et al. In vivo visualization of activated glia by [11C] (R)-PK11195-PET following herpes encephalitis reveals projected neuronal damage beyond the primary focal lesion[J].Brain，2001，124(10)：2014-2027.

(本文編輯： 董歷華)

Protective effect ofTianqiYizhigranule on inflammatory reaction in rats with Alzheimer’s disease

ZHANGJiajia，MENGFanxing，MATao，etal.

Departmentofencephalopathy，BeijingPingguHospitalofTraditionalChineseMedicine，Beijing101200,China

MengFanxing，E-mail：mengfx1971@126.com

Objective To reveal the related mechanism of Chinese traditional medicine in treatment on AD, and to explore theYiqihuoxueprescription principle forTianqiYizhigranules on the protective effect of inflammatory reaction in brain tissue of AD rats. Methods 90 rats were randomly divided into six groups(15 in each group). Five of them were injected with Aβ1-42in lateral ventricle to establish AD model rats. Treatment groups were received different doses ofTianqiYizhigranules, and control group was given huperzine. 30 days later the rats were sacrificed and the proteins in brain tissue were extracted, the western blot was applied for determination of protein expression in brain tissue, and the possible mechanism of tradition Chinese medicine in treatment of AD rats was discussed. Results (1) Compared with blank group, the expression levels of GFAP and Iba-1 in model group had significantly increased (P<0.05). (2) The expression of GFAP and Iba-1 had respectively decreased (P<0.05). (3)TianqiYizhigranules and huperzine could significantly decreased the expression of phospho-p38/t-p38 (P<0.05). (4)TianqiYizhigranules could significantly decreased the expression of iNOS and COX-2 in brain tissue (P<0.05). Conclusion (1)Aβ1-42lateral ventricle injection could imitate the AD inflammatory reaction mechanism; (2)TianqiYizhiGranules play a protective role on the inflammatory reaction in the brain of AD rats by suppressing the activation of glial cells in brain tissues, decreased the expression of phospho-p38/t-p38 and inhibited p38-NF-kappa B signaling pathway activation. Moreover, it can inhibit the expression of COX-2 and iNOS.

Alzheimer’s disease;TianqiYizhigranules; Experimental study; Inflammatory reaction

國家重大科技專項重大新藥創制專項(2013X09103002-002)

101200 北京市平谷區中醫醫院腦病科(張佳佳)；北京中醫藥大學東方醫院腦一科(孟繁興、陳路、陳志剛)，科研處(王樂)；北京中醫藥大學東方醫院科研中心、北京師范大學老年腦健康研究中心(馬濤)；中航工業北京航空制造工程研究所(劉一川)

張佳佳(1989- )，女，碩士，住院醫師。研究方向：中西醫結合治療腦病系統疾病。E-mail：18511780920@163.com

孟繁興(1971- )，女，本科，副主任醫師。研究方向：中西醫結合治療腦病系統疾病。E-mail：mengfx1971@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.003

2016-11-02)