敲除let-7a減輕腦缺血再灌注后炎癥反應和神經損傷

胡國章， 劉方方， 方 威， 范 佳

敲除let-7a減輕腦缺血再灌注后炎癥反應和神經損傷

胡國章1， 劉方方2， 方 威1， 范 佳3

目的 研究微小RNA let-7a在腦缺血再灌注后神經損傷中的作用及機制。方法 將大鼠分為假手術組、對照組、anti-let-7a組和GFP組，每組各12只大鼠，假手術組大鼠為假手術組。對照組、anti-let-7a組和GFP組分別經尾靜脈給予生理鹽水、表達anti-let-7a的AAV-9質粒或者對照空質粒實驗，然后通過線栓法建立腦缺血再灌注大鼠模型。模型建立24 h后，TTC法檢測梗死體積，tunel法檢測細胞凋亡，Western blot檢測caspase-3表達，ELISA和qRT-PCR檢測腦組織中TNF-α和IL-6 的表達。并通過Western blot、qRT-PCR和熒光報告基因驗證let-7a對MKP1表達的調控。結果 anti-let-7a組大鼠腦梗死體積明顯小于GFP組和對照組，腦組織內凋亡細胞數、caspase-3、TNF-α和IL-6 的表達明顯低于GFP組和對照組。let-7a可與MKP1 mRNA 3’UTR端結合，下調MKP1在PC12細胞中的蛋白表達。結論 敲除let-7a可通過調控MKP1表達，抑制MAPK信號通路的激活從而減輕腦缺血再灌注后的炎癥反應和細胞凋亡發揮神經保護作用。

腦缺血再灌注； let-7； 凋亡； 炎癥； 小膠質細胞

研究發現，腦缺血區域的血流再通后可能會導致進一步的組織損傷和功能障礙，這種有害情況被稱為腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷的具體機制不明，大量的實驗表明炎癥反應在腦缺血再灌注損傷中起到重要的作用。因此，怎樣抑制腦缺血再灌注損傷后炎癥反應具有非常重要的臨床意義，有望成為缺血性腦血管病的治療途徑。MicroRNA (miRNA)是一類僅有18～25個核苷酸的單鏈組成的一種小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，在細胞的凋亡、腫瘤的形成以及病毒的復制過程等多方面發揮著多元化調控作用[1,2]。近幾年缺血性腦卒中的研究逐步深入化，microRNA作為一種重要的基因水平調控因子，其與腦缺血再灌注的相關研究也相應增多[3]。之前有報道在腦缺血再灌注后，腦組織中let-7a表達顯著上調[4,5]，提示其與腦缺血再灌注病理生理過程有關。但let-7a對腦缺血再灌注后神經損傷的影響以及機制尚無相關報道。本研究以腦缺血再灌注大鼠為研究對象，通過let-7a shRNA的慢病毒載體轉染研究let-7a敲除對腦缺血再灌注后神經細胞凋亡以及炎癥反應的作用，并對其可能的作用機制進行進一步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康8～10周齡雄性SD大鼠，體質量220～250 g，由吉林大學動物實驗中心提供，各組間暴露因素無差異。

1.2 miRNA轉染 將細胞以1×105/ml加入24孔板培養孔中，含10%FBS的1640完全培養基(Gibco)培養24 h，待細胞濃度約為80%，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行轉染。let-7a mimic或inhibitor(Ribo,Guangzhou,China)及其陰性對照(Ribo Bio)的轉染終濃度均為20 nmol，轉染時間為48 h。

1.3 腦缺血再灌注模型建立及處理 將大鼠分為假手術組、對照組、anti-let-7a組和GFP組，每組各6只大鼠，假手術組大鼠為假手術組。對照組、anti-let-7a組和GFP組分別經尾靜脈給予生理鹽水、表達anti-let-7a的AAV-9質粒或者對照空質粒(由上海吉瑪生物科技有限公司代為合成)，然后制作并評估大鼠腦缺血再灌注模型。過程簡略如下：大鼠麻醉后,仰臥位固定于手術板上。頸部皮膚消毒后作正中切口，依次分離左側頸總、頸外及頸內動脈。在頸總動脈和頸外動脈，眼科剪于頸總動脈近端剪一小口，插入直徑0.26 mm鈍頭魚線，經頸內動脈到達大腦中動脈起始部。阻斷左側大腦中動脈血流2 h后，拔除魚線，結扎頸外動脈，縫合切口。大鼠復蘇后在20 ℃～25 ℃飼養，自由攝水攝食。假手術組大鼠插線未至大腦中動脈，起不到阻斷血流的作用，其余步驟與再灌注模型相同。

1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 缺血再灌注模型制作完成后1 d，所有大鼠麻醉后直接斷頭處死，取50 mg的腦組織與8倍體積的冰冷碳酸鹽緩沖液(100 mmol Na2CO3,50 mmol NaCl pH 11.5)以及蛋白酶抑制劑加入勻漿機中，20 s勻漿。然后將混合物在12 000 g下離心45 min，取上清液進行TNF-α和IL-6 含量的測定，測定方法分別按TNF-α和IL-6試劑盒(Abcam,Hongkong,China)說明書操作。根據標準曲線計算各組每毫克腦組織中TNF-α和IL-6含量。

1.5 qRT-PCR檢測mRNA Trizol法提取腦組織總RNA 使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix進行cDNA合成。將2.5 μl合成的cDNA、1 μl特異性引物與TransStartTMSYBR Green qPCR Supermix充分混合后，在ABI 7500 PCR儀(ABI,Bedford,MA,USA)上進行實時定量PCR測定，以GAPDH mRNA內參，定量產物濃度。結果以2-△△CT表示[6]。

1.6 Luciferase assay MKP1基因的3’-UTR端包含1個7 mer大小的序列與let-7a相匹配。將含MKP1 mRNA 3’-UTR的luciferase報告系統(MKP1 3’-UTR-wt)、含突變后的MKP1 mRNA 3’-UTR的luciferase報告系統(MKP1 3’-UTR-mut)和空熒光報告質粒分別與let-7a及其陰性對照mimic-NC共轉染至HEK-293細胞中。收集細胞經Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega,Madison,WI,USA)檢測熒光強度。

1.7 Western blot 提取細胞蛋白，采取BCA法測定總蛋白濃度。每個樣品取總蛋白20 μg與loading buffer混合，電泳后濕法電轉膜90 min。轉膜后經脫脂牛奶封閉2 h后，TBST洗脫6次(每次10 min)。加一抗兔抗大鼠caspase-3、MKP1和GAPDH多克隆抗體IgG (1∶1000；Abcam,Cambridge,MA,USA)，于4 ℃孵育過夜。次日TBST洗脫6次(每次10 min)。加入HRP標記的二抗羊抗兔多克隆抗體(1∶5 000；Abcam)，室溫孵育2 h后行ECL化學發光法顯示蛋白條帶，結果以蛋白條帶的灰度值比值表示。

2 結 果

2.1 抑制let-7a減輕腦缺血再灌注后炎癥反應 通過ELISA對再灌注后梗死區內TNF-α和IL-6含量進行檢測，可見anti-let-7a組大鼠腦組織中兩種炎癥介質含量均低于對照組和GFP組(P<0.05)(見圖1A)。通過qRT-PCR檢測顯示，anti-anti-let-7a組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6 mRNA明顯低于對照組與GFP組(P<0.01)(見圖1B)。

2.2 抑制let-7a減輕腦缺血再灌注后神經凋亡 Tunel染色顯示假手術組大鼠腦組織無明顯Tunel染色陽性細胞，而對照組、anti-let-7a組和GFP組大鼠皮質、海馬以及基底節區均可見大量tunel染色陽性的凋亡細胞。anti-let-7a組Tunel陽性細胞百分比明顯低于GFP組(P<0.05)(見圖2A)。并且通過Western blot檢測發現anti-let-7a組大鼠腦梗死灶內caspase-3含量明顯低于GFP組(P<0.05)(見圖2B)。

2.3 抑制let-7a減輕腦缺血再灌注后神經功能缺損 在腦缺血再灌注后24 h時對腦組織進行TTC染色，結果顯示假手術組大鼠腦組織無著色區域，對照組腦梗死區呈蒼白色。GFP組大鼠腦梗死范圍與對照組分布一致，且兩組梗死體積無明顯差異(P>0.05)。GFP組相比，anti-let-7a組大鼠腦梗死體積明顯減小(見圖3A)。實驗還對各組大鼠進行了神經功能評分， anti-let-7a組大鼠各時間段神經功能評分均低于對照組和GFP組大鼠(P<0.05)(見圖3B)。

2.4 let-7a通過與MKP1 mRNA 3’UTR結合下調其在PC12細胞中的蛋白表達 let-7a mimic可顯著降低PC12細胞中MKP1水平(P<0.05)，而let-7a inhibitor可顯著升高PC12細胞中MKP1水平(P<0.05)。通過qRT-PCR對Control、let-7a mimic、mimic-NC、let-7a inhibitor、inhibitor-NC共5組PC12細胞中MKP1 mRNA進行檢測，結果發現5組細胞中的MKP1 mRNA水平并無明顯差異(見圖4A)。MKP1 3’UTR-wt組熒光強度明顯低于其陰性對照組(miR-con)，而MKP1 3’UTR-mut組或空質粒組熒光強度與其陰性對照無明顯差異(見圖4B)。此結果表明，let-7a可以通過與MKP1 mRNA 3’UTR端結合而調節其翻譯。

與對照組、GFP組相比*P<0.05，與對照組、GFP組相比**P<0.01

圖1 抑制let-7a對腦缺血再灌注后的炎癥反應的影響

與對照組、GFP組相比*P<0.05，與對照組、GFP組相比**P<0.01

圖2 抑制let-7a對腦缺血再灌注后的細胞凋亡的影響

與對照組、GFP組相比*P<0.05，與對照組、GFP組相比**P<0.01

圖3 抑制let-7a對腦缺血再灌注后神經損傷的影響

compared to the mimic-NC or 0 h *P<0.01

圖4 miR-let7a對PC12細胞中MKP1表達的影響

3 討 論

let-7家族包括let-7a在內共有11個成員，是最早被發現在物種間高度保守且廣泛性表達的miRNAs，也是研究較為成熟的miRNA家族之一。let-7a是研究最廣泛的miRNAs之一，既往研究多集中在腫瘤方面，大量證據表明let-7a作為抑癌miRNAs對肺癌、前列腺癌和卵巢癌等不同類型腫瘤的生長和轉移起到抑制作用。近年研究發現，let-7a與神經細胞分化以及某些神經系通過疾病也有密切的聯系。包括let-7a在內的19種miRNAs在小鼠和人的神經元發育過程中表達增高[7,8]，并且let-7a可通過靶點TLX抑制神經干細胞分化[9]。為了研究let-7a的功能，實驗通過尾靜脈注射沉默let-7a表達的 AAV9載體使其在腦缺血再灌注大鼠模型腦組織中過表達，結果顯示抑制let-7a可減輕腦缺血再灌注后炎癥介質TNF-α和IL-6的表達。這些結果均表明腦缺血再灌注后抑制let-7a過度表達具有減輕神經炎癥的作用。并且抑制let-7a后腦缺血再灌注所致的神經細胞凋亡和神經功能評分情況也明顯改善。

為了尋求let-7a調節腦缺血再灌注后神經炎癥和凋亡的具體信號機制，實驗通過生物信息學方法發現在絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP1)mRNA 3’UTR上存在let-7a的潛在結合位點。MPK1屬于MKPs家族，是由早期應答基因編碼的雙重底物特異性蛋白磷酸酶，主要分布于細胞核內，主要在絲裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的去磷酸化方面發揮重要作用[10,11]。MKP1是其中效能最高、研究最深、最重要 MAPK磷酸酶，是p38、JNK1/2和ERK1/2負調控的主要因子，因而參與調節炎癥反應和細胞凋亡[12～14]。并且有研究表明，MKP1在腦缺血后具有明顯的神經保護作用[15,16]。Western blot結果證實，let-7a可下調PC12細胞中MKP1蛋白的表達，而let-7a抑制劑let-7a inhibitor可促進其蛋白表達。qRT-PCR結果發現let-7a對 mRNA表達并無明顯影響。通過luciferase assay結果可知，轉染let-7a mimic后，含野生型MKP1的3’-UTR段的熒光報告質粒的熒光表達強度明顯降低，而含let-7a的結合位點突變的熒光報告質粒的熒光表達強度則不受影響。這些結果表明let-7a可通過結合MKP1的3’-UTR段結合位點在轉錄后水平抑制MKP1的表達，這一作用并不影響MKP1 mRNA的表達。

綜上所述，實驗研究發現，腦缺血再灌注后let-7a的表達水平上調，抑制上調的let-7a可減輕腦缺血再灌注后神經炎癥反應和細胞凋亡，因而避免神經系統損傷。進一步研究發現，let-7a的促炎癥和凋亡作用是通過其靶點MKP1實現的。實驗不僅對腦缺血再灌注后炎癥反應機制的闡述做出補充，還提示進一步研究針對臨床的靶向治療途徑將具有重要的臨床意義。

[1]Pothof J,Van Gent DC.Spatiotemporal aspects of MicroRNA-mediated gene regulation[J].Adv Exp Med Biol,2011,722:75-85.

[2]Chen PY,Meister G.microRNA-guided posttranscriptional gene regulation[J].Biol Chem,2005,386(12):1205-1218.

[3]Di Y,Lei Y,Yu F,et al.MicroRNAs expression and function in cerebral ischemia reperfusion injury [J].J Mol Neurosci,2014,53(2):242-250.

[4]Jeyaseelan K,Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,2008,39(3):959-966.

[5]Dharap A,Bowen K,Place R,et al.Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral microRNAome [J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(4):675-687.

[6]Song L,Li D,Zhao Y,et al.miR-218 suppressed the growth of lung carcinoma by reducing MEF2D expression[J].Tumour Biol,2016,37(3):2891-2900．

[7]Sempere LF,Freemantle S,Pitha-Rowe I,et al.Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation[J].Genome Biol,2004,5(3):R13.

[8]Aranha MM,Santos DM,Xavier JM,et al.Apoptosis-associated microRNAs are modulated in mouse,rat and human neural differentiation[J].BMC Genomics,2010,11:514.

[9]Song J,Cho KJ,Oh Y,et al.Let7a involves in neural stem cell differentiation relating with TLX level[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,462(4):396-401.

[10]Caunt CJ，Keyse SM.Dual-specificity MAP kinase phosphatases (MKPs):shaping the outcome of MAP kinase signalling[J].FEBS J,2013,280(2):489-504.

[11]Patterson KI,Brummer T,O’brien PM,et al.Dual-specificity phosphatases:critical regulators with diverse cellular targets[J].Biochem J,2009,418(3):475-489.

[12]Kristiansen M,Hughes R,Patel P,et al.Mkp1 is a c-Jun target gene that antagonizes JNK-dependent apoptosis in sympathetic neurons[J].J Neurosci,2010,30(32):10820-10832.

[13]Wang Q,Shi S,He W,et al.Retaining MKP1 expression and attenuating JNK-mediated apoptosis by RIP1 for cisplatin resistance through miR-940 inhibition[J].Oncotarget,2014,5(5):1304-1314.

[14]Rastogi R,Jiang Z,Ahmad N,et al.Rapamycin induces mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphatase-1 (MKP-1) expression through activation of protein kinase B and mitogen-activated protein kinase kinase pathways[J].J Biol Chem,2013,288(47):33966-33977.

[15]Liu L,Doran S,Xu Y,et al.Inhibition of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1) increases experimental stroke injury[J].Exp Neurol,2014,261:404-411.

[16]Koga S,Kojima S,Kishimoto T,et al.Over-expression of map kinase phosphatase-1 (MKP-1) suppresses neuronal death through regulating JNK signaling in hypoxia/re-oxygenation[J].Brain Res,2012,1436:137-146.

Knockdown of let-7a attenuates neuroinflammation and nerve injury after cerebral ischemia-reperfusion injury

HUGuozhang,LIUFangfang,FANGWei,etal.

(EmergencyDepartment,TheChina-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To study the role and mechanism of let-7a in cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Rats were divided into Sham group,Control group,anti-let-7a group and GFP group and 6 rats were in each group.Rats in Control group,anti-let-7a group and GFP group were given saline by tail vein,anti-let-7a expression of AAV-9 plasmid or control empty plasmid experiments respectively,and then establish cerebral ischemia and reperfusion model.Infarct volume was examined using TTC staining and apoptosis was evaluated using Tunel staining and caspase-3 detection.The expression of TNF-α and IL-6 in brain tissue was detected by ELISA and qRT-PCR.The regulation of let-7a on the expression of MKP1 was confirmed by Western blot,qRT-PCR and luciferase assay.Results The infarct volume of anti-let-7a group was significantly smaller than that of GFP group and control group,the number of apoptotic cells,the expression of caspase-3,TNF-α and IL-6 in brain tissue were significantly lower than that of GFP group and Control group.Let-7a binds to the MKP1 mRNA 3’UTR end and down-regulates the expression of MKP1 in PC12 cells.Conclusion Knockout of let-7a can inhibit the activation of MAPK signaling pathway by regulating the expression of MKP1,thus excerting the neuroprotective effect against inflammatory reaction and apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion.

Cerebral ischemia-reperfusion; let-7; Apoptosis; Inflammation; Microglia

1003-2754(2017)06-0528-04

2017-04-12；

2017-06-02

(1.吉林大學中日聯誼醫院急診醫學科，吉林 長春 130033;2.吉林市中心醫院神經內科，吉林 吉林 130000;3.吉林大學第二醫院神經內科，吉林 長春 130041)

范 佳，E-mail:neurology@139.com

R743.3

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