胃癌細胞中Rab25相互作用蛋白的鑒定及功能學研究

王一丞，李園園

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胃癌細胞中Rab25相互作用蛋白的鑒定及功能學研究

王一丞1，李園園2

目的 通過串聯親和純化聯合質譜技術(TAP-MS)篩選胃癌細胞中Rab25相互作用蛋白。方法 利用慢病毒轉染技術構建穩定表達StrepII-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的SGC7901細胞系；通過StrepII-6His標簽進行串聯親和純化獲得與Rab25相互作用的蛋白復合物，并通過質譜檢測蛋白復合物的組成；隨后構建了Rab25蛋白質相互作用網絡，并通過免疫共沉淀技術驗證其在胃癌細胞中相互作用的真實性。結果 通過TAP-MS技術共鑒定出26個Rab25的相互作用蛋白，主要參與癌癥通路、微管運動、細胞凋亡、NOTCH通路等過程；運用免疫共沉淀方法驗證了Itgb1與Rab25相互作用的真實性，并通過Transwell試驗證實Rab25和Itgb1協同促進SGC7901細胞的侵襲。結論 通過鑒定胃癌細胞中Rab25的相互作用蛋白網絡，為胃癌的治療提供一個新的線索。

胃癌；Rab25；蛋白質相互作用；串聯親和純化；質譜

腫瘤發生轉移是胃癌患者死亡的一個重要因素，這個過程通常伴有特定細胞因子和細胞信號轉導通路的變化，因此對胃癌發生、轉移過程中相關細胞因子和細胞信號轉導通路的研究將推動胃癌診斷與治療技術的不斷發展[1]。Rab25屬于Rab蛋白家族的一種小GTP結合蛋白，僅在肺、腎、胃腸黏膜等上皮組織中特異性表達，功能上是一種運輸蛋白，在細胞內參與信號傳導、細胞骨架形成、細胞內物質運輸等重要過程[2]。最近研究表明，Rab25可影響胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，調節腫瘤血管生成、能量代謝、整合素循環及參與上皮間質轉化等多個過程[2]，而這一過程主要是由Rab25及其相互作用蛋白復合物共同完成的。因此，明確胃癌細胞中Rab25的相互作用蛋白，對胃癌的早期診斷、預后監測及靶向基因治療有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 載體構建 以Rab25 cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列為：正向引物5′-CTGTACATGGGGAATGGAACTGAGGAA-3′，反向引物5′-AGAATTCTCAGAGGCTGATGCAACAGG-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段，用BsrGI和EcoRI分別雙酶切目的片段和FUGW-StrepII-6His-EGFP載體。酶切產物膠回收后16 ℃連接過夜，連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證后獲得FUGW-StrepII-6His-EGFP-Rab25質粒。

1.2 穩定過表達細胞系構建 為獲得穩定表達StrepII-6His-EGFP-Rab25融合蛋白(實驗組)和StrepII-6His-EGFP融合蛋白(對照組)的胃癌細胞，將生長旺盛的SGC7901細胞接種于24孔板(4×104/孔)，待細胞密度生長到60%左右時，更換新鮮Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)完全培養液并加入含有StrepII-6His-EGFP-Rab25或StrepII-6His-EGFP序列的慢病毒顆粒，感染36 h后將細胞移入6孔板中繼續生長，72 h后用流式細胞儀分析表達EGFP細胞的百分比。

1.3 串聯親和純化 收集3×107個細胞，用預冷的PBS緩沖液清洗細胞2次，向細胞中加入1 ml預冷的細胞裂解液，液氮反復凍融3次，10 kg離心15 min，收集上清液并用0.45 μm濾器過濾備用。將上清液與100 μl anti-StrepII beads在4 ℃孵育結合4 h，用細胞裂解液洗去未結合的雜蛋白。用1 ml洗脫液在4 ℃洗脫anti-StrepII beads 2 h，1000 g離心5 min，收集洗脫液。將洗脫液與100 μl anti-6His beads在4 ℃孵育結合2 h，用細胞裂解液洗去未結合的雜蛋白，將結合在anti-6His beads上的蛋白復合物-80 ℃凍存備用。

1.4 酶切和質譜分析 使用200 μl含有100 mM碳酸氫銨溶液清洗結合有蛋白復合物的anti-6His beads，1000 g離心去上清。加入100 μl 10 mol/L二硫蘇糖醇溶液作用30 min，隨后加入100 μl 200 mM碘乙酰胺避光作用45 min，最后加入1 μg胰酶37 ℃酶切24 h。將酶切產物10 kg離心10 min，取含有肽段的上清進行質譜鑒定。質譜分析采用UltiMate 3000納升液相色譜+Bruker maxis 4G UHR-TOF質譜儀進行檢測。10 μl的樣品進入戴安C18柱(75 μm×15 cm，3 μm，100 ?)進行濃縮和快速除鹽，分析柱用以下梯度進行梯度洗脫：5～65 min乙腈濃度從5%上升至35%，65～75 min乙腈濃度從35%上升至80%，并在80%保持5 min，75～90 min乙腈濃度返回到5%，納升泵流速控制在350 nl/min。肽段梯度洗脫后經納升電噴霧系統(ESI)進入質譜分析儀進行蛋白質鑒定，其中毛細管電壓為1800 V，掃描模式為Auto MS/MS，掃描范圍為50～1500 m/z，掃描速率為4 Hz，質量誤差為±0.05 Da。

1.5 免疫共沉淀實驗 將1×107的SGC7901細胞用預冷PBS洗滌2次，加入1 ml的IP細胞裂解液(Beyotime公司)冰上裂解30 min，然后12 kg，4 ℃離心15 min，收集上清液并測定蛋白濃度。取500 μg蛋白樣品，加入1 μg和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG及20 μl充分重懸的Protein A + G Agarose以降低背景，4 ℃緩慢搖動1 h，1000 g離心5 min后收集上清。在上清中加入1 μg用于免疫沉淀的一抗，4 ℃緩慢搖動孵育過夜，次日加入20 μl充分重懸的Protein A + G Agarose，4 ℃緩慢搖動孵育4 h。1000 g離心5 min后去除上清，IP細胞裂解液洗滌5次，加入20 μl電泳上樣緩沖液，煮沸處理5 min，離心后取部分樣品進行分析。

1.6 Western Blot 在結合有Rab25蛋白復合物的anti-6His beads中加入50 μl 蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，1000 g離心5 min后收集上清。20 μl上清液進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，100 V電泳2 h。采用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置在冰浴，100 V，2 h條件下將蛋白轉移至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗，4 ℃過夜孵育；TBST漂洗3次，加入二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL化學發光，Bio-Rad成像系統顯影。

1.7 siRNA轉染實驗 采用Roche公司的X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent進行siRNA轉染實驗，Rab25及Itgb1干擾序列購買至Invitrogen公司。將生長旺盛的SGC7901細胞接種到6孔板中(2×105/孔)，待細胞密度生長到50%左右時進行轉染實驗。按照轉染試劑說明書將siRNA及轉染試劑混合物加到6孔板中，轉染體系為200 μl，siRNA終濃度為100 nmol/L。72 h后收集細胞并采用Western Blot實驗檢測干擾效果。

1.8 Transwell體外侵襲實驗 采用Corning公司Transwell小室侵襲模型，并用Matrigel進行包被。6孔板下室加1 ml含有10%胎牛血清的培養液，上室中加入200 μl細胞懸液(1.0×105/ml), 培養36 h后取出，PBS洗膜后刮除上室底部基質膠，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下計數侵襲細胞數量。每張膜取5個視野，每組重復3次。

2 結 果

2.1 穩定表達StrepII-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的SGC7901細胞系構建 以Rab25 cDNA為模板，PCR擴增Rab25 CDS區片段(642 bp)，將產物進行1%瓊脂糖電泳并回收(圖1)。用BsrGI和EcoRI分別將PCR片段及目的載體FUGW-StrepII-6His-EGFP雙酶切，然后進行連接獲得FUGW-StrepII-6His-EGFP-Rab25質粒，測序結果提示構建成功。 通過磷酸鈣沉淀法，成功將慢病毒表達及包裝質粒FUGW-StrepII-6His-EGFP-Rab25、psPAX2和pMD2.G共轉染至293T細胞，獲得重組慢病毒顆粒，隨后將慢病毒顆粒感染SGC7901細胞，獲得穩定表達StrepII-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的細胞。以EGFP為標記進行流式細胞分選，分選后檢測細胞表達融合蛋白陽性率為99.3%(圖2)。

圖1 Rab25 PCR擴增后電泳分析

圖2 流式分析表達StrepII-6His-EGFP-Rab25 融合蛋白SGC7901細胞陽性率

2.2 Rab25相互作用蛋白鑒定及功能分析 基于TAP-MS連用技術檢測Rab25相互作用蛋白，3次重復實驗數據利用Mascot軟件收索Swiss-Prot數據庫共鑒定出215個蛋白。進一步通過陰性對照排除雜質蛋白影響后，選取在3次重復檢測中出現2次的蛋白，并按照Mascot分數、匹配的片段數和覆蓋率等進行綜合評定，最終獲得可信度相對較高的26個相互作用蛋白(表1)。通過收索BIND、HPRD、BioGRID蛋白質相互作用數據庫，確定26個蛋白之間的相互作用關系，構建了以Rab25為中心的蛋白質相互作用網絡(圖3)。并采用DAVID在線分析系統進行基因注釋分析，根據生物學途徑注釋聚類分析表明這26個相互作用蛋白主要富集在癌癥通路、微管運動、細胞凋亡及NOTCH通路上(圖3)。

2.3 Rab25與Itgb1相互作用的鑒定 通過檢測親和純化后Rab25相互作用復合物中的Itgb1，證明Rab25和Itgb1相互作用明顯(圖 4A)。隨后采用免疫共沉淀方法驗證Rab25和Itgb1在SGC7901細胞中的內源性結合，結果證明Rab25和Itgb1存在內源性相互作用(圖 4B-C)。

2.4 Rab25和Itgb1協同促進SGC7901細胞侵襲 通過特異性siRNA干擾，我們成功抑制SGC7901細胞內Rab25和Itgb1的表達(圖5)。采用Transwell試驗評估干擾Rab25和Itgb1后對SGC7901細胞侵襲作用的影響，結果顯示，無論是干擾Rab25或Itgb1都明顯抑制細胞的侵襲能力，同時干擾兩種蛋白后抑制細胞侵襲能力作用更加明顯(圖6)。

圖3 Rab25相互作用網絡圖及通路表1 胃癌細胞中Rab25的相互作用蛋白

相互作用蛋白基因號蛋白全名Acvr190activinAreceptortype1Ankrd61100310846ankyrinrepeatdomain61Ap2s11175adaptorrelatedproteincomplex2sigma1subunitAsns440asparaginesynthetase(glutamine-hydrolyzing)Atp4a495ATPaseH+/K+transportingalphasubunitBrd38019bromodomaincontaining3Brd423476bromodomaincontaining4Fam3b54097familywithsequencesimilarity3memberBFbxl2084961F-boxandleucine-richrepeatprotein20Fig49896FIG4phosphoinositide5-phosphataseHsp90aa13320heatshockprotein90kDaalphafamilyclassAmember1Hsp90ab13326heatshockprotein90kDaalphafamilyclassBmember1Irf2bp126145interferonregulatoryfactor2bindingprotein1Itgb13688integrinsubunitbeta1Mif4282macrophagemigrationinhibitoryfactor(glycosylation-inhibitingfactor)Myo1551168myosinXVANono4841non-POUdomaincontaining,octamer-bindingOptn10133optineurinPkig11142proteinkinase(cAMP-dependent,catalytic)inhibitorgammaPrpsap25636phosphoribosylpyrophosphatesynthetaseassociatedprotein2Ruvbl18607RuvBlikeAAAATPase1Sfpq6421splicingfactorproline/glutamine-richTgfbr17046transforminggrowthfactorbetareceptorITubb2a7280tubulinbeta2AclassⅡaTubb310381tubulinbeta3classⅢTubb4b10383tubulinbeta4BclassⅣb

圖4 Rab25與Itgb1相互作用的鑒定

A.StrepII-6His標簽純化后Itgb1的檢測；B.免疫共沉淀檢測Rab25和Itgb1相互作用(利用Rab25抗體)；C.免疫共沉淀檢測Rab25和Itgb1相互作用(利用Itgb1抗體)

圖5 siRNA干擾后Rab25和Itgb1的表達情況

圖6 Rab25和Itgb1對SGC7901細胞侵襲能力的影響 ①P<0.05,②P< 0.001

3 討 論

蛋白質是有機體的重要組成成分，是細胞功能的主要執行者，且主要是通過蛋白質-蛋白質相互作用的方式發揮其功能特性。通過蛋白質組學研究和胃癌相關的蛋白質相互作用網絡，將能更好地闡明胃癌發生、發展及轉移機制，有利于解決胃癌的早期診斷和靶向治療問題。

本研究利用高效的Strep-6His串聯標簽標記Rab25蛋白，通過親和純化聯合質譜檢測的方法，篩選獲得26個相對可靠的相互作用蛋白質。運用生物信息學手段對篩選的相互作用蛋白進行基因注釋分析，結果表明這些蛋白主要定位在腫瘤相關通路、微管運動、細胞凋亡及NOTCH通路上，而這些信號通路在細胞生長、增殖、分化及腫瘤發生過程中發揮重要調節作用，強烈提示Rab25與腫瘤的發生發展密切相關。腫瘤相關通路中的Hsp90aa1和Hsp90ab1是蛋白進行正確折疊的重要分子伴侶，其功能異常導致多種腫瘤發生，其高表達將導致胃癌細胞浸潤并直接影響患者預后[3]；Tgfbr1和Mif的表達程度和胃癌細胞浸潤、淋巴結轉移及TNM分期呈正相關，此外也可能與幽門螺桿菌感染導致的胃癌密切相關[1,4]。

細胞凋亡信號通路異常與胃癌的發生也存在密切相關，高表達Brd2、Brd3的胃癌患者總體生存率明顯下降，這可能和其調控細胞染色質乙?；芮邢嚓P[5]；Irf2bp1可通過增強泛素化進程調控胃癌相關基因的轉錄活性，進而調控細胞的凋亡[6]；Acvr1屬于TGF-b超家族成員，在調節胃癌細胞生長上發揮重要作用[7]。研究表明，NOTCH信號通路與胃癌細胞分化、凋亡、增殖密切相關，Sfpq和Nono作為該通路中的兩個重要蛋白，能夠相互作用形成異二聚體增強斷裂DNA重新修復，其缺失將導致S期細胞的異常積累而導致癌癥的發生[8]。此外，Optn、Myo15、Tubb2a、Tubb3和Tubb4b主要參與了微管相關運動，這也與Rab25介導囊泡轉運的基本功能相關。

研究表明，Itgb1作為整合素家族的重要成員，通過促進基質金屬蛋白酶的分泌和活化，降解細胞外基質，在多種腫瘤的侵襲和轉移過程中起到重要作用[9]。腫瘤細胞中過表達Rab25將加快細胞膜上整合素回收，導致腫瘤細胞的侵襲和轉移[10]。這些研究提示Rab25和Itgb1可能在胃癌細胞的生物學功能上存在聯系，而質譜結果也表明Rab25和Itgb1有可能有相互作用。為了進一步確認數據的可靠性，我們通過免疫共沉淀實驗證明了Itgb1和Rab25相互作用的真實性，并通過Transwell試驗證實了Rab25和Itgb1協同促進胃癌細胞侵襲。

本研究為深入了解Rab25及其相互作用蛋白在胃癌中的作用機制提供新的思路和方法，以期為胃癌的治療提供理論依據。

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(2017-03-02收稿 2017-04-10修回)

(責任編輯 武建虎)

Identification and functional analysis of Rab25-interacting proteins in gastric cancer cells

WANG Yicheng1and LI Yuanyuan2.

1. Department of Servicemen，Chongqing Municipal Corps Hospital，Chinese People’s Armed Police Force, Chongqing 400061,China;2.Air Force Aviation Medicine Identification and Training Center, Dalian 116013, China

Objective To identify Rab25-interacting proteins in gastric cancer cells using tandem affinity purification-mass spectrometry (TAP-MS).Methods An SGC7901 cell strain that could stably express Rab25 was constructed using a StrepII-6His-EGFP-Rab25 expressing plasmid by lentivirus transfection technology. After StrepII-6His tandem affinity purification, mass spectrometry was carried out to analyze the interaction protein complex of Rab25. To further verify their interactions, a protein-protein network was constructed and the authenticity of interactions was verified by co-immunoprecipitation in gastric cancer cells.Results A total of 26 Rab25 interacting proteins were identified by TAP-MS technique, which were enriched in the cancer process, apoptosis, NOTCH-mediated pathway and microtubule-based movement. Co-immunoprecipitation analysis confirmed that Itgb1 interacted with Rab25, and that they collaborated to promote the invasion of SGC7901 cells according to Transwell invasion assays.Conclusions This study helps to draw a detailed map of Rab25 interactions and provides clues for treatment of gastric cancer.

gastric cancer; Rab25; protein-protein interaction; tandem affinity purification; mass spectrometry

王一丞，碩士，醫師。

1.400061，武警重慶總隊醫院軍人病區；2.116013，空軍大連航空醫學鑒定訓練中心

R34；R735.2