間充質干細胞的臨床應用若干問題

范宏杰，劉利龍綜述，黃建強，趙 衛 審校

·綜 述·

間充質干細胞的臨床應用若干問題

范宏杰1，劉利龍2綜述，黃建強1，趙 衛1審校

間充質干細胞(MSCs)有著獨特的生物學特性，其免疫調節能力和多向分化能力更為許多難治性疾病的治療帶來了希望。然而，歷經了半個世紀，以MSCs為基礎的細胞治療仍然未能普遍地被接受。文章從MSCs的制備、安全性、有效性、醫學倫理和質量管控等方面綜述MSCs在研究中和臨床應用過程中存在的問題。

間充質干細胞；安全性；有效性；細胞治療；成瘤性

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成體干細胞中的一員，廣泛存在于身體的各種組織，易于分離和體外擴增。MSCs強大的自我更新能力、多向分化功能、免疫調節能力和來源廣泛的特性，使其在以治療難治性疾病為目的的干細胞領域占據一席之地。MSCs被廣泛的用于再生醫學、組織工程、基因治療、細胞治療等前沿學科，被認為是較為理想的種子細胞，有著巨大的科研和臨床應用價值。毋庸置疑，以MSCs為基礎的治療方法為臨床疑難雜癥的治療提供了新思路、為廣大患者健康的恢復帶來了希望。但是，隨著大量動物實驗和臨床試驗研究的深入，MSCs臨床應用中暴露出的問題也越來越多，尤其是安全性問題，廣泛地引起了科研人員和臨床醫師的關注，MSCs能否像一般藥物一樣流通于市場并廣泛用于臨床、造福于人類社會仍然存在著諸多爭議。

1 安全性問題

1.1 制備過程中的安全性問題

1.1.1 供體的選擇和純度等問題 制備過程中應該嚴格MSCs供體的選擇，尤其供體是患者本身，要充分了解供者的遺傳背景以及既往病史等，明確是否有遺傳性疾病和身體健康狀況是否符合要求；要嚴格體檢，盡可能地排除對MSCs產生不良影響的因素，如免疫缺陷病毒、人類T淋巴細胞病毒等；年齡也是重要的影響因素之一，不同年齡的供者之間MSCs的分化能力有明顯的異質性[1]，總體來說年齡越大，誘導成功率越低，要盡量避免在年老體弱者身上提取MSCs。再者，不同組織來源的MSCs受特異性基因表達的影響，其表面特征和功能會有一定差異，有必要按組織源性進行選擇。制備和運輸、保存過程中要盡可能保持無菌狀態，污染了的MSCs會影響實驗結果或傷害到患者，且有些病毒是無法完全消除的。到目前為止，MSCs分離的方法有貼壁培養法、免疫磁珠法、密度梯度離心、流式細胞儀分選法等多種，但每個方法有一定不足之處，如貼壁培養法獲得的MSCs純度不夠高、免疫磁珠法和流式細胞儀分選法價格昂貴，且會損傷細胞，影響存活率，常需要多種方法結合起來。另外，培養過程中添加物的理化特性如濃度過高或過低[2]、一些儀器設備不恰當的操作如離心機轉速過快等，可導致細胞受損，降低存活率。目前，在獲得純度高、添加物干擾少、存活率高的健康MSCs方面，尚無一套可行性、易行性、安全性較高的標準制備流程或操作方法。

1.1.2 添加物的使用 制備期間，抗生素、血清、誘導劑等添加物的使用不可避免，這些外來物質有可能會傳播病毒、細菌、朊病毒、支原體、內毒素等，也可能在植入機體后發生排斥反應。胎牛血清是一種不夠精確的常用添加物，批次之間常有變化，其含有的異基因蛋白質可進入MSCS或分布于MSCs表面，這可能改變MSCs的增值特性及免疫調節能力甚至引起機體免疫排斥[3]。Paula等[4]在人類的同種異體血清下培養MSCs，提高了其c-MYC的表達和細胞穩定性，細胞均正常進入衰老狀態，無染色體變異、腫瘤形成等表現，這是更為理想的無異基因培養環境。多數學者認為，很有必要引進無異基因蛋白質的胎牛血清替代品或可行的無血清培養環境來制備MSCs[5-7]。制備過程中要盡量避免外來物質和環境因素對MSCs產生不良影響，以提高所制備的MSCs質量和安全性。

1.1.3 鑒定和誘導分化 MSCs的鑒定方法有待完善，目前多采用的是相差顯微鏡觀察細胞形態和表面標志物檢測。人們對MSCs表面抗原的認識局限于體外培養過后的MSCs，且并非所有的細胞均表達某些特定抗原，目前仍難找到有特異性的表面標記[8]。實驗和臨床中需要MSCs完全按期望的方向進行分化，這對MSCs的分化微環境提出了嚴格要求，如MSCs誘導分化為成骨細胞需要加入一定濃度的β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松等[2]，部分MSCs并不會分化為目的細胞而是分化為其他細胞，可控性仍需要提高，這和組織來源有關。

1.2 表型改變和成瘤性 MSCs的安全性需注意其制備和應用過程中的成瘤性問題，細胞治療興起以來，干細胞治療引發腫瘤，已成為腫瘤發病新的重要機制[9]。

1.2.1 MSCs的惡變 MSCs臨床應用前，常需要大量的擴增已達到臨床應用需要的數量，然而，長時間擴增可導致MSCs表觀遺傳變異、形態和生物特性改變、無限增殖甚至腫瘤形成。在培養期間，細胞發生遺傳或表觀遺傳的改變會增加MSCs自發惡性轉變的概率，這種轉變常伴隨著P53、RB等抑癌基因的丟失和一些基因的激活及超表達[10-11]。因此，在培養的MSCs用于臨床之前，要明確長時間培養擴增過程中基因組和表觀遺傳穩定性相關因子是否有改變，并作安全性評估。MSCs可用于如帕金森病、脊髓損傷、腦缺血、非特異性炎癥等神經系統疾病的治療，有很多研究者認為MSCs在神經系統疾病的治療中有可行性且不易發生腫瘤。Zeira等[12]選了8只確定有不明原因的腦脊膜腦脊髓炎癥狀的病犬，在征得主人同意情況下進行骨髓來源的MSCs治療，臨床護理6個月到2年。結果顯示所有病犬均無重大不良反應或惡變，一般狀況和神經系統癥狀有改善。Maia等[13]用骨髓來源的MSCs通過鞘內注射治療10只雌雄參半的馬脊髓損傷，也證明了其有效性和可行性。但需要指出的是大多類似的實驗，實驗動物數量太少，且培養時間較短，不能以此確定治療某種疾病，尤其是人類疾病治療的可行性或者安全性。Amariglio等[14]的研究中，觀察了1個在胚胎神經干細胞治療4年后確診為多發行腦腫瘤的患者，從分子和細胞遺傳等多方面檢測，發現此病例腫瘤并非自體產生的而是來源于移植的干細胞。這些研究表明，干細胞治療導致腫瘤發生風險的擔憂并非毫無根據，目前還迫切需要進一步的工作來評估這類細胞治療的安全性。

1.2.2 特定環境可誘發MSCs惡變 體外培養或植入后的MSCs在一定的微環境下易發生惡變，如低氧、化學物質誘導、生物因素等。生理狀況下，低氧環境較為常見，也普遍存在于胚胎干細胞和成體干細胞發育的早期階段，在維持干細胞特性方面有著舉足輕重的作用。病理狀態下也會出現低氧環境，如腫瘤的形成和生長、受傷、關節炎、缺血性心臟病等，這種環境影響MSCs的歸巢和移植。為了適應這些生理或病理環境，MSCs必須對各種原因導致的不斷變化的低氧環境作出感應和調整。Nekanti等[15]研究了低氧微環境下華通氏膠來源的MSCs的增值和分化特點，他們在實驗中觀察到，低氧狀態下MSCs的HIF-1α、HIF-2α的mRNA表達水平提高，Notch受體和配體以及下游基因HES1的表達均較正常環境的MSCs表達有明顯提高，早期中胚層和內皮基因表達提高如DESMIN、 CD34、 ACTC等，β-gal染色測細胞衰老情況發現很少有細胞進入衰老階段，形態學上大部分變為寬大扁平的細胞，因此認為長期在低氧環境下培養必然引起MSCs的惡性轉化。生物因素會影響MSCs的增值、分化、惡性轉化，病毒便是其中一種。病毒對MSCs有很強的感染作用，如一些逆轉錄病毒、腺病毒、瘋牛病毒等。Valle等[16]對MSCs的致癌性進行了深入研究，他們用多瘤病毒JCV的T抗原等誘導鼠骨髓來源的成體MSCs使其經歷腫瘤形成轉變，并將之植入裸小鼠中，比較了植入與未植入MSCs的裸小鼠的區別；在此期間MSCs有致癌性轉化，腫瘤生長過程中伴隨表現型的改變，這種誘導干細胞惡性轉化可為研究提供一類新型的腫瘤模型。Tang等[10]的研究中分離了10個捐獻者的臍帶源性MSCs，評估他們的自發情況下惡化潛力和致癌劑3-甲基膽蒽誘導下的惡化情況。他們通過形態學變化、增殖率、細胞的衰老能力、端粒酶活性、染色體異常和形成腫瘤的能力來評估其惡性轉化情況。結果發現自發組的臍帶源性MSCs歷經49.5 d均進入衰老，未自發惡化；而3-甲基膽蒽誘導組中，MSCs的增值率均明顯提高，有2例在300 d的實驗時間內均未能進入衰老狀態，細胞形態發生明顯變化。這些MSCs的端粒逆轉錄酶表現為高活性，在體外長期培養過程中端粒并未縮短，端粒長度的改變是MSCs惡變為腫瘤的重要特點，MSCs明顯地維持較長的端粒長度，為細胞逃避衰老提供了途徑，因而得到了經久不衰的增殖潛力。[10,17]

1.2.3 腫瘤環境的MSCs 有研究表明，腫瘤細胞和MSCs之間有著相互作用，腫瘤組織在MSCs的影響下也可以表達間充質細胞標記物Vim、CK、CD99，一些腫瘤細胞能分泌趨化因子、細胞因子等活性小分子物質刺激MSCs的遷移并募集MSCs于腫瘤細胞周圍[10,18]，MSCs也可分泌一些可溶性分子如趨化因子CCL-5等來提高腫瘤細胞的遷移。MSCs是腫瘤基質的重要組分，被認為是腫瘤相關的成纖維細胞的前體[19]。處于腫瘤部位的MSCs持續暴露于腫瘤微環境的免疫細胞和炎癥細胞因子/趨化因子中，由此獲得不同于一般組織MSCs的功能，這些獨特的功能在調節腫瘤微環境和促進腫瘤生長中起著重要作用。Ren等[20]從自發淋巴瘤的小鼠中分離出了MSCs，發現這種MSCs能有效地招募單核細胞、 巨噬細胞和中性粒細胞到腫瘤，用TNF-α刺激骨髓來源的MSCs模擬淋巴瘤源性MSCs趨化因子的產生和功能，并促進了淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌的發生和生長。因此，腫瘤部位的MSCs與免疫細胞有交互作用，能通過募集巨噬細胞和單核細胞提高腫瘤的生長。

1.3 其他 MSCs應用廣泛，組織工程、基因治療、細胞移植等多個領域均有應用。然而，關于其不良反應的報道也較為常見，干細胞治療可能導致多種疾病，如動脈硬化癥[21]、胃癌[22]、骨肉瘤[23]、兒童白血病等。由于很難回顧性地鑒別人類成熟的腫瘤細胞的源細胞，尤其是這些細胞表達不僅只有一種細胞類型的標記物， 大多數類型的腫瘤細胞的起源仍然未知[24]。MSCs經過體外培養后，細胞體積變大，植入血管后更不易通過一些細小管道，在血流、細胞間相互作用等影響下易形成細胞團塊，阻塞血管影響血流，嚴重可導致局部組織缺血壞死,MSCs治療有導致心肌梗死、血栓、栓塞等風險[25]。另外，MSCs的作用靶點、長期治療后果、體內存留或轉歸仍然不夠明確，其是否能長期存留、有何機制、存留后對機體是否有影響、該如何應對等均有待于深入探究。

2 有效性問題

2.1 MSCs生物學特性的改變 MSCs經過體外培養過后，生物學特性會發生改變，有學者將體外培養的不均一的MSCs群體也稱為間充質基質細胞， 表達CD73、CD105等，伴隨分化且植入性、自我更新能力減弱，其不均一性表現在2周內形成的成纖維細胞集落形成單位大小、增值能力、分化能力的不同[8]。MSCs在培養過程中如控制不好，會失去原有的活性或生物學特性，形成無效的細胞或分化為非目的細胞。生物學特性改變過后的MSCs可能會上調促炎作用的細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL1、IL8、IL-32、CXCL10、LIF、ICAM、CCR1；相反，對有抗炎作用的IL-10等活性因子失去分泌能力[26]。Rodriguez等[27]的研究中，MSCs經過致癌性轉化后炎癥調節功能、前列腺素合成調節功能削弱，喪失了對有免疫抑制作用的PGE2和PGI2的分泌功能，并且產生了具有促炎作用的凝血噁烷類物質；人類白細胞抗原HLA-2和CD86分子的表達上調，導致了MSCs能表達MHC-Ⅱ類分子和CD86，分泌炎癥細胞因子和趨化因子活化T淋巴細胞，進而喪失免疫抑制作用。轉變后的MSCs通過改變有關酶活性和功能的途徑改變了前列腺素類分子的合成，表現為高表達PTGS2和PTGS1，低表達PTGES, PTGIS, and PTGDS。MSCs有復制衰老現象，體外增值過程中經歷時間如果較長，細胞的形態學、活性、分化能力等方面會改變，會在一定程度上降低其植入性，影響存活率[28-29]。這些特征性改變會導致應用過程中有效性的降低，甚至可能在一些疾病的治療過程中根本無效。

2.2 移植后MSCs的低存活率 MSCs的注入途徑有多種：靜脈、局部、動脈、肌肉、鞘內注射等。靜脈注射的MSCs會經右心房、右心室、再到肺，肺的截留作用會減少干細胞的體內循環數量，導致MSCs主要分布于肺并且大多數死亡，到達靶組織或損傷組織的量已經很少，療效被大幅度削弱[30]。局部注射的MSCs有可能引起局部組織的病理反應，加重病情。另外MSCs進入機體后，大部分會因缺氧、營養物質缺乏等環境因素而死亡，少數存活的MSCs并分泌相關的細胞因子、趨化因子而起作用，MSCs移植后的存活率仍然很低。如能提高其植入性和體內存活率，必然會對疾病的治療帶來積極效應，并加快其臨床應用的步伐。

2.3 MSCs的適應與禁忌證 MSCs的禁忌證和禁忌證目前仍無統一的規范化標準。目前適合用MSCs治療的疾病有很多，如骨缺損為代表的組織工程疾病[31]、血液病造血干細胞移植、再生醫學、基因治療等。然而MSCs并非萬能的，過去的幾十年里，MSCs的作用很多時候被過分地夸大，隨著研究的深入，不適合用MSCs治療的疾病也越來越多地被揭示。有很多疾病應該被列為MSCs治療的禁忌證或相對禁忌證，如高度過敏體質者、全身器官衰竭、晚期惡性腫瘤、嚴重感染、艾滋病、乙肝、梅毒、凝血功能障礙性疾病如血友病等。另外，如糖尿病、COPD等疾病目前已經有較好的治療體系，MSCs治療作為可選擇的治療途徑或許會有一定的效果，但也需要從患者的經濟能力、機體承受力等多角度多社會因素權衡其中的利弊，采取更為有效的治療措施。

3 倫理性和監管方面的問題

3.1 倫理性問題 MSCs從供體如胎盤、臍帶、血液、骨髓等器官或組織收集，需要征得供體提供者的同意，且要對供體提供者進行全面體檢，以保障獲得優質的MSCs并盡可能地排除對受體身體造成傷害的可能；MSCs的使用要嚴格控制，不應該無視道德底線地亂用、濫用；MSCs用于治療患者前，要充分地向患者說明病情以及MSCs的作用、可能帶來的已知的危害或是未知的影響，讓患者理解干細胞治療現狀，并征得患者的同意。

3.2 干細胞監管問題 干細胞治療的監管程序十分復雜，采集、建庫、制備、檢測、保存、運輸等會導致誤差累積，每個程序需要的人員資質和環境應有嚴格要求[7]，很有必要作出界定、準入管理，按照質量控制要求進行嚴格監管。其復雜程度堪比一門新興學科，目前尚未形成一套行之有效的方法，相關部門應給予重視。對干細胞實驗的前后及臨床應用進行評估及強制性規范的制度迫切需要，盡管可能會因此在一定程度上阻礙科學研究[32]，但可相對有效地維護患者的利益。干細胞治療技術牽涉面甚廣，有關道德倫理、監管、實驗和治療標準等問題的分歧一直都存在。甚至以“人文關懷”為依據的干細胞治療，仍然面臨著不被接受的尷尬[33]。因此，有必要形成較為成熟、統一的監管體系，來使干細胞治療工作標準化。

4 結 語

MSCs來源廣泛，有著極強的自我更新、免疫調節、多向分化等功能，為股骨頭壞死[34]、心肌梗死[35]、腦創傷[36]、血管疾病[37]等多種難治性疾病的治愈帶來了希望，為廣大患者帶來了福音。然而，以MSCs為基礎的細胞療法，仍然有許多問題需要在將來得到解決，如對MSCs免疫調節能力、體內外行為和應答機制的進一步認識，MSCs致瘤性和特異標志物的缺乏，MSCs低存活率和如何提高移植率等；提示我們該療法在用于臨床治療前，必須要投入完成大量的基礎研究或動物實驗[38]。MSCs仍未能作為適于臨床的，安全性、可行性、易行性、可控性、有效性高的商品流行起來，這里面的倫理問題、監管問題仍然存在爭議。不可否認MSCs治療仍有著廣闊的應用前景，但這種爭議短期內仍然難以消除，這也是廣大科研工作者和臨床醫師在使用MSCs的時候需要考慮的。

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(本文編輯:劉玉巧)

1. 650032昆明, 昆明醫科大學第一附屬醫院影像中心;2.430022武漢, 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院泌尿外科

黃建強,E-mail：jq2008h@163.com

范宏杰，劉利龍，黃建強,等.間充質干細胞在臨床應用中的幾個問題[J].東南國防醫藥，2017,19(3): 285-289.

R318

A

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2017-02-06;

2017-04-20)