番鴨基因多態性與羽毛相關性分析

董飚 秦豪榮 徐琪 李曉鳴 紀榮超 王健

摘要：為探討黑素皮質素受體1（melanocortin-1 receptor，簡稱MC1R）基因對番鴨羽色的影響，采用PCR和直接測序法對番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區進行多態性分析，比較不同羽色番鴨群體遺傳參數和基因型分布卡方檢驗。結果表明：在番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區發現G274A、G279A、C485A突變，使第92處氨基酸由谷氨酸（E）變為賴氨酸（K），第162處的氨基酸由蘇氨酸（T）變為天冬氨酸（N）。通過各個位點不同羽色番鴨群體基因型、等位基因頻率的比較分析，同時結合不同群體間基因型分布卡方檢測，發現在第279處的G-A突變中白羽番鴨僅有GG型，而其他3個攜帶大量黑羽的番鴨群體都以GA、AA型存在；同時全白番鴨與其他3個番鴨群體之間卡方值最大，推測此位點對番鴨的羽色影響較大。而從其他2個突變位點的數據分析推測，它們對番鴨的羽色幾乎沒有影響。研究結果為開展番鴨羽色研究和育種工作奠定了基礎。

關鍵詞：番鴨；[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因；羽色；多態性；相關性分析

中圖分類號： S834+.892 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0024-03[HS）][HT9.SS]

番鴨是優良的肉鴨品種，原產于南美洲和中美洲的熱帶地區，具有生長速度快、瘦肉率高等特點。在我國番鴨已有200多年的養殖歷史，開始以農戶散養所占比例較大，現在已逐漸形成規模化養殖。除了純白羽番鴨外，國內還有很多黑羽番鴨，白羽和黑羽交叉存在，有些有規律，如有些黑羽番鴨僅在頭或翅膀部位存在白羽，其他部位均為黑羽，有些幾乎全為黑羽。通過常規的育種手段想選育成全黑羽番鴨是很難的，隨著分子生物學技術的發展，功能基因的作用機理也逐漸被挖掘。研究表明，禽類羽色是個多基因控制的性狀，遺傳復雜，基因間有顯隱性、互作、上位等關系，要想準確控制番鴨的羽色是一個比較大的難題。

黑素皮質素受體1（melanocortin-1 receptor，簡稱MC1R）基因的編碼區只含有1個外顯子，不同動物可編碼氨基酸的數量不同，一般長度為310個，是最小的G蛋白耦合受體，具有7個跨膜結構域[1]。它通過與內源配體促黑激素結合來促進腺苷酸環化酶的活化，提高環腺苷酸水平，激發酪氨酸酶水平的提高，導致黑色素的形成，實現對動物膚色、毛色或羽色的調控[2-3]。目前已知一些[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因變異可引起動物黑色素形成的變化以及毛色/羽色的變異，師科榮等通過分析我國11個地方豬種和3個國外引入豬種的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因多態性，發現僅從[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因上發生的突變看，我國地方豬種的毛色與引入豬種毛色分屬截然不同的遺傳體系，我國地方豬種的毛色屬于顯性黑毛色體系，而且該基因對我國地方豬種毛色的差異沒有起到關鍵的影響作用[4]。Deng等發現[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因一個突變位點與我國地方豬種的黑毛色有關[5]。唐賀等分析了3個地方黃牛群體和1個引進品種的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區的變異情況發現，該基因E座位對牛的毛色有重要影響，E+和ED等位基因與黑色表型有關，而e等位基因與紅色表型有關，但黃色、棕色和紅色表型還與其他座位基因相關聯[6]。楊永升等以絲羽烏骨雞與明星肉雞為親本建立的資源家系群體雞來檢測[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區的多態性，結果發現，這些突變位點與雞的膚色、脛色、肉色等性狀有關，推測[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因可能是雞黑色素性狀的主效基因或者與雞控制黑色素性狀的主效基因連鎖[7]。[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因A356G處的突變是控制他留烏骨雞羽色的一個關鍵變異位點[8]。另外，還有很多關于動物[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因突變的報道，但是沒有與毛色/羽色進行相關分析，或者有些突變與動物毛色/羽色無關。

在此基礎上，本試驗擬運用PCR和直接測序技術檢測不同羽色番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突變位點，分析不同羽色番鴨群體[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的基因型頻率、等位基因頻率以及遺傳參數等數據，為番鴨羽色研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗動物

分別采集全黑（簡稱QH，指所有羽毛幾乎為黑色，部分會在翅膀部位出現1～2根白羽）、白翅（簡稱BC，翅膀一半以上為白色，其他部位幾乎為黑色）、白頭（簡稱BT，頭部羽毛為白色，夾雜少量黑羽，其他部位均為黑色）和全白（簡稱QB，全身白羽）番鴨血樣各60個，用肝素鈉抗凝，離心留取血紅細胞，用常規酚/氯仿抽提法提取番鴨基因組DNA，并溶于蒸餾水中，用核酸濃度測定儀檢測其濃度和純度，然后稀釋成50～100 ng/μL備用。

1.2引物設計[JP+1]

根據GenBank中公布的鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因序列（EU877264）設計了1對引物P1，P1上游序列為F：5′-CGACGTGCCCAACGAAC-3′，下游序列為R：5′-CTGGCTCCGGAAGGCATAGAT-3′，擴增產物長度為793 bp，退火溫度為58 ℃。[JP]

1.3PCR擴增反應

PCR反應體積為25 μL，10×PCR buffer（Mg2+ 15 mmol/L） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加蒸餾水補足至25 μL。

1.4測序

擴增產物用瓊脂糖凝膠進行檢測，對符合預期結果的PCR產物進行膠純化回收，將純化產物直接送公司測序，將不同個體的測序結果用DNAMAN軟件進行比較，即可獲得[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在番鴨群體中存在的差異。

[HTK]1.5數據處理[HT]

運用遺傳學統計公式計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態信息含量，并分析基因型在不同羽色番鴨群體中分布的差異性。

2結果與分析

2.1測序和基因型識別

將不同個體測序結果進行比較發現，在擴增的片段中存在3個突變位點，分別為編碼區第274、279、485處的G-A、G-A和C-A突變（圖1箭頭標記處），其中第274處突變導致氨基酸由谷氨酸（E）變為賴氨酸（K），第485處突變導致氨基酸由蘇氨酸（T）變為天冬氨酸（N），第279處的突變沒有引起氨基酸序列發生變化。[FL）]

基因第274處G-A突變形成了GG、GA、AA型，全黑番鴨群體以GA、AA型為主，白翅番鴨以AA型為主，白頭番鴨以GG型為主，全白番鴨3種基因型較為接近。全黑和白翅番鴨群體中以A等位基因為主，白翅番鴨群體中幾乎均為A等位基因，白頭番鴨群體以G等位基因為主，全白番鴨群體2個等位基因頻率較為接近。在4個番鴨群體中，全白番鴨的雜合度和多態信息含量最高，分別為0.499 4、0.374 7；全黑番鴨群體雜合度為0.383 2，多態信息含量為0309 8；白翅和白頭番鴨群體雜合度和多態信息含量較低（表2.3G279A位點遺傳信息分析

基因第279處G-A突變形成了GG、GA、AA型，全白番鴨群體只存在GG型，其他3種番鴨群體均只存在GA型、AA型，白翅、白頭番鴨群體以AA型為主，全黑番鴨群體GA型和AA型較為接近。全黑、白翅和白頭番鴨群體均以A等位基因頻率為主，其中白翅番鴨A等位基因頻率最高。4個番鴨群體中，全黑的雜合度和多態信息含量最高，白頭番鴨群體次之（表3）。

由表4可知，4個番鴨群體之間基因型分布存在極顯著差異，其中以白頭番鴨和白翅番鴨之間差異最小，全白番鴨和其他3個羽色番鴨的差異最大。

2.4G485A位點遺傳信息分析

基因第485處C-A突變形成了CC、CA、AA型，4個番鴨群體均以CC型為主，白翅番鴨群體只有CC型，全黑和白頭番鴨群體只有CC型和CA型。所有群體中，均以C等位基因頻率為主。全白番鴨群體雜合度和多態信息含量最高，分別為0.420 0、0.331 8，白頭番鴨群體次之（表5）。

由表6可知，4個番鴨群體之間基因型分布存在顯著差異，[JP3]部分群體之間基因型分布存在極顯著差異，其中以白翅番鴨和全黑番鴨之間差異最小，白翅番鴨和全白番鴨之間差異最大。[JP]

識別位點，該位點為同義突變，通過分析發現，A399G位點與羽色沒有顯著性相關，但是番鴨基因型全為AA型，家鴨的基因型全為GG型，半番鴨幾乎均為AG型，從而推斷該位點可以有效鑒定和區分家鴨、白番鴨和半番鴨3類鴨群體[9-10]。本研究通過PCR、測序方法檢測了[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在不同羽色番鴨群體中存在單核苷酸突變情況，通過序列比對，在編碼區發現3處突變，分別位于第274、279、485處的G-A、G-A、C-A 突變，第274處和第485處的突變使得這2處的氨基酸序列發生了變化，分別為谷氨酸（E）變為賴氨酸（K）和蘇氨酸（T）變為天冬氨酸（N），這與夏波報道的在此區間發現的9個多態位點[11]相比要少一些，而且部分位點突變還不一樣，這可能與試驗所用的番鴨群體不同而存在差異。

為了解這些突變是否與番鴨羽色有關，本研究還分析了不同羽色番鴨各個突變位點的基因型頻率和基因型分布卡方檢驗。在第274處的G-A突變位點，全黑和白翅番鴨中不存在GG型，而白頭番鴨幾乎都是GG型，全白番鴨3個基因型頻率差不多。4個群體不同基因型分布卡方檢驗，雖然不同群體之間基因型分布存在極顯著差異，但是白頭番鴨與全黑番鴨、白翅番鴨的卡方檢驗值較大，全白番鴨與其他3個群體的卡方檢驗值次之，推測此位點對羽色影響不大，這與夏波報道的結果不同，他認為該位點與番鴨羽毛顏色差異有關，這可能與試驗番鴨群體所用樣品量（2羽白羽番鴨、2羽黑羽番鴨）較少有關[11]。在第279處的G-A突變位點，3個攜帶了黑羽的番鴨群體都以GA、AA型存在，而全白番鴨以GG型存在，結合不同番鴨群體之間基因型分布卡方檢驗值，全白番鴨與其他3個番鴨群體之間卡方值最大，推測此位點對番鴨的羽色影響較大。在第485處的C-A突變位點，白翅番鴨以CC型存在，全黑番鴨和白頭番鴨以CC型和CA型存在，全白番鴨3種基因型都存在，所有群體都以CC型頻率最高，結合不同群體番鴨基因型分布卡方檢驗，4個番鴨群體之間基因型分布卡方檢驗值差異與羽色沒有明顯關系，推測此位點對羽色影響不大。由此可以推測，[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突變位點不一定都會影響番鴨的羽毛顏色。

純合度、雜合度、多態性信息含量（polymorphic information content，簡稱PIC）是群體遺傳參數分析常用數據，其中雜合度和PIC可用來衡量基因多態性豐富程度和群體遺傳變異水平的高低。本試驗所用4個群體在不同突變位點其雜合度和PIC差異較大，這與每個位點的基因型種類和雜合子的比例有關。如果群體基因型種類單一，雜合子的比例少，則群體的雜合度、PIC就偏低。通過雜合度和PIC分析可知，群體在某個突變位點的遺傳變異程度，如果雜合度和PIC值都偏大，則說明群體保持了良好的遺傳信息，可選擇的范圍廣泛；反之，則遺傳信息小，可選擇的范圍也比較窄。

參考文獻：

[1]甘海云，李建斌，王紅梅，等. 黑素皮質激素受體1基因與牛的毛色[J]. 家畜生態學報，2007，28（3）：99-102.

[2]楊永升，李寧，鄧學梅，等. 黑素皮質素受體1——哺乳動物黑色素形成中的關鍵基因[J]. 遺傳，2004，26（4）：544-550.

[3]Sizuki I，Cone R D，Im S，et al. Binding of melanotropic hormones to the melanocortin receptor [WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ] on human melanocytes stimulates proliferation and melanohenesis[J]. Endocrinology，1996，137（5）：1627-1633.

[4]師科榮，王愛國，李寧，等. 中國地方豬種黑素皮質激素受體1基因（[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]）的單核苷酸多態性[J]. 中國科學（生命科學），2004，34（2）：144-149.

[5]Deng S H，Gao J，Ren J，et al. Studies of the relationship of melanocortin receptor 1 （[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]） gene with coat color phenotype in pigs[J]. Journal of Genetics and Genomics，2003，30（10）：949-954.

[6]唐賀，高英凱，苗永旺. 4個黃牛群體黑素皮質受體1（[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]）基因變異研究[J]. 畜牧獸醫學報，2010，41（6）：639-643.

[7]楊永升，鄧學梅，李寧，等. [WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]是控制雞黑色素形成的候選主效基因[J]. 生物化學與生物物理進展，2004，31（6）：500-505.[JP]

[8]騰召純，陸曉屏，王玉祥，等. [WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因Taq Ⅰ PCR-RFLP標記與他留烏骨雞羽色性狀的相關性研究[J]. 中國家禽，2013，35（20）：11-14.

[9]鄭嫩珠，黃虹虹，陳暉，等. 半番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因SNP位點的發現和PCR-RFLP多態性分析[J]. 中國家禽，2009，31（18）：11-13，18.

[10] 辛清武，鄭嫩珠，朱志明，等. 8個鴨群體[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因A399G位點變異分析[J]. 中國農學通報，2014，30（35）：69-73.

[11]夏波. 鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因突變與羽毛顏色差異相關性研究[D]. 雅安：四川農業大學，2008.