田七炭疽病病原的分離與鑒定

韋榮昌 唐其 白隆華

摘要：炭疽病是田七生長發育過程中一種嚴重的病害，為明確引起炭疽病的病因，從引起田七葉片穿孔和褐化的樣本上分離病原，對病原進行致病性測定，對顯微形態和rDNA ITS分子進行鑒定。結果表明，2種田七炭疽病病原分別為人參炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

關鍵詞：田七；炭疽病；人參炭疽菌；膠孢炭疽菌；病原鑒定；發生規律；病害防治

中圖分類號： S435.675文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0086-03

田七[Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen]別稱三七、山漆、金不換、南方神草等，為五加科（Araliceae）人參屬（Panax）多年生草本植物，主要以根和根莖入藥[1]。田七為我國著名的傳統中藥，是人參屬植物中皂苷類分子多樣性最豐富、含量最高、最有醫療保健價值以及最具有開發利用前景的藥材[2]，在中樞神經系統、血液系統、心腦血管系統以及免疫系統等方面具有較好的生理活性[3-7]，廣泛應用于藥品、食品、保健品和化妝品中。然而，由于獨特的生態環境及嚴重的連作障礙，導致田七病害發生種類多、發病重[8]。2014—2015年，筆者在廣西壯族自治區南寧市各地田七病害的田間調查中發現了造成田七葉片穿孔和褐化的2種病害，導致葉片大量脫落，嚴重影響藥材的質量和產量。本研究通過病原分離和鑒定，確認人參炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）侵染田七是造成其葉片穿孔和褐化的主要原因，為進一步系統研究該病的發生規律及其病害防控提供參考。

1材料與方法

1.1標本來源及癥狀描述

標本來源于廣西藥用植物園田七種植基地，通過田間自然感病和人工接種發病葉片進行癥狀描述。

1.2病原菌的分離純化及致病性測定

選取染病田七葉片，在病健結合組織處切取0.5 cm小塊，依次用75%乙醇浸泡30 s，0.1%氯化汞消毒2 min，滅菌水漂洗3～5次，置于PSA培養基上26 ℃恒溫培養，待菌絲長出后挑取菌落的邊緣進行純化，通過單孢分離純化后的菌落，得到純培養分離物。待分離獲得的菌株經單孢純化后，保存于PSA培養基斜面上，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

依據針刺接種法進行病原菌致病性測定，在健康的田七葉片上接種純培養的分離物（菌絲塊），置于26 ℃的恒溫培養箱內保濕培養，3次重復，以未接種的健康田七葉片作對照，定期觀察葉片的發病情況。對接種發病的葉片進行病原菌再分離，觀察分離得到的病原菌是否與接種菌株相同。

1.3形態學鑒定

對PSA平板上的病原菌菌落特征及產孢情況進行觀察分析，同時對分生孢子進行革蘭氏染色，顯微測定分生孢子盤、分生孢子梗長以及分生孢子的大小。

1.4分子生物學鑒定

1.4.1DNA提取

采用易潤華等的方法[9]，用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因組DNA。

[CM（26]1.4.2rDNA ITS區的擴增及測序

以ITS1（5′-TCCGTAG[CM）][LM]GTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物，PCR擴增菌株的rDNA ITS序列。反應體系：10×Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L Primer ITS1 2 μL，10 μmol/L ITS54 2 μL，Genomic DNA 20 ng，5 U/μL Ex Taq 0.5 μL；ddH2O補足至50 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 復性80 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

用瓊脂糖凝膠電泳擴增PCR產物，回收目標DNA片段，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序。通過BioEdit校對測序結果，進行序列拼接，把拼接好的系列與GenBank數據庫中的序列進行Blast相似性比對，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.05軟件的Neighbor-Jorning法構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1病害癥狀

標本1，葉片染病初生圓形或近圓形黃褐色病斑，中間呈灰褐色至灰色，邊緣黃色暈圈明顯，后期病部易破裂穿孔，病斑較小，直徑2～5 mm（圖1）。標本2，病菌主要從葉緣侵入，在葉片上形成半圓形或“V”形病斑，有輪紋，中間呈紅褐色至灰褐色，后期具有黑色小點，周圍有黃暈，病斑較大，直徑8～15 mm（圖1）。

2.2致病性測定

接種葉片表現出與自然病葉相同的癥狀，未接種葉片表現正常，從回接發病田七葉片上可以100%得到原接種病菌。

2.3形態學鑒定

在PSA平板上，病原菌tg-1菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變為淺黃褐色，菌絲毛絨狀，不會形成分生孢子盤；分生孢子為單胞、無色，呈長橢圓形或棍棒狀，大小為（6.0～16.0）μm×（2.5～5.5）μm，平均為12.0 μm×4.0 μm（圖1）。

在PSA平板上，病原菌hb-2菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變為灰白色或深灰色，菌絲棉絮狀；分生孢子盤呈黃褐色墊狀突起，圓形，直徑（85.0～210.0） μm，無剛毛；分生孢子梗短，略呈倒棒狀，（8.0～11.0）μm×（3.0～4.0）μm；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大小為（9.0～13.0）μm×（3.0～5.0）μm，平均為 11.0 μm×4.0 μm（圖1）。

2.4分子生物學鑒定

使用真菌ITS區域的引物ITS1和ITS4，對病原菌tg-1、hb-2進行擴增，分別獲得大小為568、556 bp的片段。將擴增產物測序所得的序列拼接后與GenBank中核酸數據進行Blast比對分析，結果發現，tg-1與已報道的多個人參炭疽菌的序列同源性最高，相似性達99%；從系統發育樹也可以看出，tg-1與人參炭疽菌的遺傳距離最近（圖2）；hb-2與多個膠孢炭疽菌的序列同源性最高，相似性達100%。系統發育樹也表明，hb-2與多個膠孢炭疽菌的遺傳距離最近（圖2）。參照文獻[10-11]，結合病原菌形態學及分子生物學鑒定結果，分別將病原菌tg-1、hb-2鑒定為人參炭疽菌和膠孢炭疽菌。

3討論與結論

近年來，隨著廣西壯族自治區政府“田七回家”扶貧項目的啟動，眾多農民選擇種植田七脫貧致富，然而田七炭疽病的發生，嚴重影響田七產業的健康發展和農民的增收。作為世界上分布最廣的植物病原菌之一，炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質性等方面可分為多種亞組，屬多形態種[12]，且其分生孢子形態多相似。因此，單從形態學鑒定菌種顯得尤為困難，須要借助分子生物學加以鑒定[13]。就進化速度來說，rDNA ITS區域比編碼區快，可以提供更多變異來進行種間或種內的分子系統研究。本研究根據形態學特征和分子生物[CM（25]學分析結果，將引起田七葉片穿孔和褐化的田七炭疽病病[CM）][FL）]

原菌鑒定為人參炭疽菌或膠孢炭疽菌，但有關該病害的發生流行規律、侵染循環、防治措施以及抗性品種的選育有待進一步研究。

rDNA ITS序列測定是當前常用的植物病原分子鑒定方法，然而本研究中病原菌tg-1的rDNA ITS序列既與人參炭疽菌的對應序列具有99%的同源性，也與希金斯炭疽菌（C. higginsianum）99%同源，單靠分子生物學的方法難以鑒定，說明rDNA ITS序列在炭疽病菌（或其他病菌）的鑒定中還存在一定的局限性，須要與形態學特征等傳統鑒定方法相結合才能更好地進行病原鑒定。

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