甘肅省蘋果炭疽病病原鑒定及ITS序列分析

馬永強(qiáng)

摘要：果實(shí)炭疽病是蘋果生產(chǎn)中常見的重要病害之一。通過形態(tài)特征結(jié)合病原菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer sequence，簡(jiǎn)稱ITS）區(qū)域比對(duì)分析，確定引起甘肅蘋果果實(shí)炭疽病的病原為膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）。

關(guān)鍵詞：甘肅省；蘋果炭疽病；膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）；ITS序列分析

中圖分類號(hào)： S436.611.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0089-02

果實(shí)炭疽病是蘋果生產(chǎn)中普遍發(fā)生的重要病害，包括果實(shí)上的苦腐病（bitter rot of apple）和葉片上的葉枯病（glomerella leaf spot）[1]。典型的蘋果炭疽病病菌通常僅危害果實(shí)，引起果實(shí)表面形成圓形病斑，后期產(chǎn)生呈同心輪紋狀排列的小粒點(diǎn)，病部橫切剖面呈圓錐形，果肉變褐腐爛，具苦味[2]。蘋果炭疽病在世界上所有氣候溫暖濕潤、適宜種植蘋果的國家和地區(qū)都有發(fā)生，如美國、澳大利亞、英國、法國、德國、丹麥、保加利亞、荷蘭、俄羅斯、巴西、墨西哥、日本、韓國等[3]。蘋果果實(shí)炭疽病通常在果實(shí)近成熟時(shí)開始發(fā)病，采收后貯藏期間繼續(xù)發(fā)展，造成采前大量落果和采后貯藏中發(fā)生果腐，病果率達(dá)30%左右，嚴(yán)重可達(dá)50%～60%，我國每年因炭疽病造成的果品采后損失為20%～30%，采后果實(shí)腐爛已是生產(chǎn)中的突出問題[4]。2013年筆者調(diào)查了甘肅省蘋果主產(chǎn)區(qū)果實(shí)炭疽病的發(fā)病率，通常在0.8%～13.6%，屬輕、中度發(fā)生。通過采樣和室內(nèi)分離鑒定，旨在明確病原菌的種類，為生產(chǎn)中科學(xué)制定防控策略提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1病樣標(biāo)本采集及病原菌分離

2013年9月從甘肅省隴南市禮縣永平鄉(xiāng)、永興鄉(xiāng)、祁山鄉(xiāng)、天水麥積區(qū)伯陽鎮(zhèn)、清水縣永清鎮(zhèn)等蘋果主產(chǎn)區(qū)采集炭疽病標(biāo)樣，蘋果品種為紅元帥。病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法，對(duì)采集的標(biāo)樣進(jìn)行分離純培養(yǎng)后，將菌種保存在試管斜面上。[JP]

1.2致病性測(cè)定

致病性測(cè)定參照張榮等的方法[5]。選擇有代表性的菌株，將供試菌株移于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)，7 d后用無菌水洗下分生孢子，配置成分生孢子懸浮液，濃度為1×105 個(gè)/mL。取健康的紅元帥蘋果，用自來水清洗表面，70%乙醇表面消毒，自然風(fēng)干，將捆扎在一起的5根7號(hào)昆蟲針于乙醇燈上燒灼消毒，冷卻后，扎刺果實(shí)，形成深度2.5 cm 的傷口，用移液槍向傷口中注入20 μL孢子懸浮液，25 ℃恒溫箱內(nèi)保濕培養(yǎng)。對(duì)照用無菌水接種。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。觀察病記錄接種結(jié)果。對(duì)接種發(fā)病的病斑再次進(jìn)行組織分離。

1.3病原菌形態(tài)鑒定

選取具有代表性的菌株移植于PDA 平板上，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察病原菌在PDA平板上的菌落特征、培養(yǎng)性狀，7～10 d后，挑取分生孢子團(tuán)，進(jìn)行鏡檢，觀察分生孢子的形態(tài)特征，并用顯微測(cè)微尺測(cè)量分生孢子大小。

1.4病原菌ITS序列測(cè)定與分析

病原菌的DNA提取和核糖體rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)域的擴(kuò)增與測(cè)序委托上海基康生物技術(shù)有限公司完成。

1.4.1DNA提取

病原菌DNA提取采用White等的方法[6]。[JP]

1.4.2核糖體rDNA ITS區(qū)域的擴(kuò)增與測(cè)序

擴(kuò)增所用引物為ITS區(qū)通用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[7]。PCR反應(yīng)體系總體積為25.0 μL：10×PCR 緩沖液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，超純水14.3 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性30 s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。取 5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外投射儀下檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，DNA Marker DL 2000。用北京博大泰克生物工程有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，擴(kuò)增產(chǎn)物上樣ABI3730DNA 測(cè)序儀檢測(cè)，采用雙脫氧測(cè)序法，測(cè)序引物為ITS1-F /ITS4，進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4.3病原菌rDNA ITS 序列分析

選擇具有代表性的菌株，將所測(cè)得到菌株ITS的序列加入到NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）網(wǎng)站，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTA”程序，與GenBank中海量的微生物序列進(jìn)行比對(duì)，查找相似性較高的序列，并以FASTA的格式從GenBank下載。所有的序列用Clustal X（1.83）進(jìn)行校排。校排結(jié)果用人工借助BioEdit 5.0.9.1進(jìn)行修正。最后用序列分析軟件MEGA 510進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony）分析，ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)重復(fù)1 000次得到最大簡(jiǎn)約樹。

2結(jié)果與分析

2.1致病性測(cè)定

將分離純化好的代表性菌株tj4927接種健康的紅元帥蘋果，3 d后，接種病菌的蘋果開始發(fā)病，10 d后，癥狀表現(xiàn)明顯，初發(fā)病時(shí)，果面上出現(xiàn)淺褐色、有清晰邊沿的針頭大的圓形小斑，以后逐漸擴(kuò)大，病部色澤隨之加深，并向下凹陷，蘋果表面產(chǎn)生圓形的同心輪紋狀病斑，其上產(chǎn)生黑色顆粒（分生孢子盤）（圖1-A），切開后果實(shí)內(nèi)呈漏斗狀（圖1-B），發(fā)病癥狀與田間一致；對(duì)照蘋果果實(shí)未見發(fā)病。對(duì)接種發(fā)病的病斑再次進(jìn)行病菌分離，結(jié)果表明，分離得到的病原菌與接種的病原菌培養(yǎng)性狀一致，說明分離得到的病原菌為蘋果炭疽病病原菌。

2.2病原菌形態(tài)鑒定

將菌株tj4927接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 左右即長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，邊緣整齊，淺灰色至鼠灰色，氣生菌絲絨狀，產(chǎn)生黑色的分生孢子堆，后期產(chǎn)生橘紅色分生孢子團(tuán)（圖1-C）；分生孢子單胞、無色、橢圓形或圓筒形，兩端鈍圓，大小（11～20） μm×（3.0～4.5） μm（圖1-D）。根據(jù)培養(yǎng)性狀及分生孢子形態(tài)特征，菌株tj4927鑒定為膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.3病原菌ITS序列分析

以葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）種為外群，通過

[FK（W17][TPMYQ1.tif][FK）]

種間ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，如圖2所示。通過系統(tǒng)樹分析可知，4種不同種類炭疽菌與菌株tj4927、tj4953、tj4989、tj4967、tj4977、tj4963、tj4982和tj4979聚在同一分支上，且菌株tj4927、tj4953、tj4989、tj4967、tj4977、tj4963、tj4982和tj4979與已知菌AJ301919和AJ301988以100%的支持強(qiáng)度聚集在同一分支上，應(yīng)為同一種，即膠孢刺盤孢（

3討論

王曉鳴等最早將我國蘋果炭疽病的病原鑒定為膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）[8]，此后一直認(rèn)為我國蘋果炭疽病的病原為膠孢炭疽菌，生產(chǎn)中防治也是針對(duì)這一種病原菌進(jìn)行。Sutton首次提出尖孢刺盤孢（Colletotrichum acutatum）是引起蘋果炭疽病的病原菌之一[9]，此后美國、日本、挪威等國均有研究表明，蘋果炭疽病由C. gloeosporioides和C. acutatum 2種病原引起[10-13]。張榮等研究了陜、豫2省蘋果炭疽病病原菌后發(fā)現(xiàn)，尖孢刺盤孢（C. acutatum）可引起蘋果果實(shí)炭疽病[5]。符丹丹通過蘋果炭疽病菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，簡(jiǎn)稱GAPDH）、幾丁質(zhì)酶（CHS-1）和β-微管蛋白2（TUB2）單基因及多基因聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育分析方法對(duì)遼寧、山東、河南和陜西等省蘋果主產(chǎn)區(qū)蘋果炭疽病進(jìn)行鑒定，確定我國蘋果炭疽病病原菌可分為7個(gè)分類單元，包括6個(gè)已知種、1個(gè)新種，其中引起果實(shí)苦腐病的病原菌有6個(gè)種，分別為異國刺盤孢（C. alienum）、果生刺盤孢（C. fructicola）、膠孢刺盤孢（C. gloeosporioides）、睡蓮刺盤孢（C. nymphaeae）、暹羅刺盤孢（C. siamense）和新種-東方刺盤孢（C. orientalis），蘋果炭疽葉枯病的病原分2個(gè)種，即隱秘刺盤孢（C. aenigma）和果生刺盤孢（C. Fructicola），說明蘋果炭疽病病原菌復(fù)雜多樣[1]。

本研究通過形態(tài)特征結(jié)合病原菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS

區(qū)域比對(duì)分析，確定引起甘肅省蘋果果實(shí)炭疽病的病原為膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides），有關(guān)甘肅省蘋果炭疽病病原菌的多樣性有待進(jìn)一步研究。

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