云南松毛蟲腸道中產脂肪酶菌的研究

安曼云 焦麗麗 伊煒 崔立華

摘要：采用微生物篩選培養和酶學方法，研究了云南松毛蟲腸道內產脂肪酶菌群及產酶特性，為松毛蟲的綜合開發利用提供理論依據。結果表明，從云南松毛蟲幼蟲腸道內共分離篩選獲得193株產脂肪酶的菌株，涉及3個菌屬：82株假單胞菌屬（Pseudomonas）、67株芽孢桿菌屬（Bacillus）和44株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）；其中，假單胞菌屬為優勢菌群，占總菌株數量的42.49%；供試的9株菌株表現出不同的產脂肪酶活性，并從中篩選得到了1株高產脂肪酶菌株P-50，最適作用溫度為35 ℃，pH值為8，經發酵至60 h時生長量達到最大，在48 h左右時酶活性達到最高；P-50初步確定為中溫產堿性脂肪酶菌。

關鍵詞：云南松毛蟲；產脂肪酶菌；酶活性；假單胞菌屬

中圖分類號： Q814文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0093-03

近年來，隨著胃腸道微生態理論的深入研究，有關昆蟲腸道微生物的研究已成為新熱點[1-2]。脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，廣泛存在于動植物組織微生物體中，其中發現能產脂肪酶的細菌約有28個屬[3-4]。目前，已在多種昆蟲腸道中發現各類產酶菌群，并對酶學性質進行了研究，昆蟲腸道中存在不同功能的菌群[5-8]。由于微生物脂肪酶作用的溫度和pH值范圍比動植物脂肪酶的更寬，易獲得較高純度酶制劑，適合于工業上大規模生產[9-10]。因此，不斷篩選出具有新特性和高活性的脂肪酶是一項非常有意義的工作。

云南松毛蟲（Dendrolimus houi Lajonquiere）屬鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasiocampidae），是林業的重大害蟲之一，但是從營養學和資源學的角度來看，它又具有極大的開發利用價值[11-12]。目前國內外對松毛蟲的研究主要集中在防治方面，且在相關產酶微生物資源研究時，多從土壤、淤泥中分離篩選，但對松毛蟲的利用以及腸道微生物的研究報道較少[13]。由于松毛蟲長期食用多種松類針葉，對松油脂有著特殊的消化體系，可能腸道內存在著特殊的微生物菌群資源[14-15]。因此，本研究擬以云南松毛蟲為試驗材料，研究松毛蟲腸道內產脂肪酶菌株及酶學特性，為松毛蟲的綜合利用及產脂肪酶微生物新資源的開發提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1云南松毛蟲

采自云南省楚雄州永仁縣云南松母樹林，共計60只幼蟲。

1.1.2培養基

試驗培養基名稱及配方[16]。分離培養基：肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；脂肪酶篩選培養基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、橄欖油20.0 mL、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；活化培養基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、橄欖油20.0 mL、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；高產脂肪酶菌株篩選培養液：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、橄欖油20.0 mL、云南松節油 20 mL，pH值=7.0；發酵培養基：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、云南松節油20 mL，pH值=8.0。

1.2試驗方法

1.2.1產脂肪酶菌株的分離篩選及分子鑒定

用無菌水飼養云南松毛蟲1 d后，解剖蟲體取其腸道，經研磨、稀釋后涂布于分離培養基上，37 ℃培養48 h。挑取形態各異的純菌落接種到脂肪酶篩選培養基進行培養，篩選能產生透明圈的菌株。對菌株進行DNA提取[細菌DNA提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司]，采用16S rDNA通用引物進行16S rDNA序列的擴增和測序分析。計算分離率及分離頻率。

[JZ]分離頻率=a/b×100%。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數量，株；b為分離的真菌菌株數量，株。

[JZ]分離率=a/c×100%。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數量，株；c為分離樣品總數，60只。

1.2.2高產脂肪酶菌株篩選

從假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌3個菌屬中分別選取3株供試菌株篩選高產脂肪酶，分別為P-13、P-50、P-106；P-03、P-19、P-154；P-06、P-28、P-67。將這9株供試菌株分別接種于高產脂肪酶菌株篩選培養液中培養（以云南松節油為底物，橄欖油作對照底物），48 h后測定脂肪酶活性（采用醋酸銅比色法[17]）。

1.2.3高產菌株酶解特性、生長量、產酶特性確定

設置5個反應溫度梯度（25、30、35、40、45 ℃）和5個pH值梯度（50、6.0、7.0、8.0、9.0）測定酶活性，確定最適溫度以及在最適溫度下的最適pH值。將高產脂肪酶菌株接種于發酵培養液中繼續培養，24 h后每隔12 h測定菌株生長量及酶活性。

2結果與分析

2.1云南松毛蟲腸道中產脂肪酶菌株的篩選

從云南松毛蟲幼蟲腸道內共分離篩選獲得193株產脂肪酶的菌株，涉及3個菌屬：82株假單胞菌屬（Pseudomonas）、67株芽孢桿菌屬（Bacillus）和44株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（表1）。產脂酶菌在云南松毛蟲腸道中的分離率較高，最低的為73.33%，說明云南松毛蟲腸道中存在有大量的產脂酶菌群。在這3個菌屬中，假單胞菌屬為優勢菌群，占總菌株數量的42.49%；克雷伯氏菌屬最少，為22.80%。

2.2云南松毛蟲腸道中高產脂肪酶菌株的篩選

9株產脂肪酶菌株對橄欖油和云南松節油2種底物的水解活性不同。由圖1可知，當以松節油為底物時的酶活性大于對照橄欖油為底物時的酶活性（菌株P-154除外），菌株 P-154的酶活性表現最低，而且偏向于底物橄欖油。以松節油為底物時，云南松毛蟲腸道中產脂肪酶菌群的酶活性表現為假單胞菌屬（酶活性平均值4.80 U/mL）>克雷伯氏菌屬（2.94 U/mL）>芽孢桿菌屬（2.65 U/mL），其中假單胞菌屬中菌株P-50的酶活性最大，為5.06 U/mL，初步確定為高產脂肪酶菌株。

2.3高產脂肪酶菌株酶學性質分析

由圖2可知，P-50的最適宜溫度為35 ℃，其酶活性達4.7 U/mL（圖2-a）。在最適溫度35 ℃條件下，P-50的最適pH值為8時，酶活性達到最大值（圖2-b），說明菌株 P-50 為中溫產堿性脂肪酶菌。

2.4高產脂肪酶菌株生長及產酶特性

以D600 nm值來衡量菌株P-50的生長量，P-50的生長量是隨著培養時間的延長而增加，當培養60 h左右時，生長量達到最大值，隨后不再增加（圖3-a）。而在P-50生長對數時期，培養48 h時P-50表現出較高的酶活性，為 5.8 U/mL，隨后緩慢下降（圖3-b）。

3結論與討論

昆蟲腸道中蘊含豐富的微生物資源，從中篩選出具有新特性和高活性的脂肪酶是一項非常有意義的工作。本研究首次從云南松毛蟲幼蟲腸道內共分離獲得193株產脂肪酶的菌株，涉及3個菌屬：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和克雷伯氏菌屬，其中假單胞菌屬為優勢菌群，占總菌株數量的42.49%。結果表明，長期寄生于松毛蟲腸道中的產脂酶菌群種類豐富多樣，為脂肪酶菌資源的開發利用提供了新的來源途徑。目前，生產上常見的產脂肪酶菌株主要有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、

[FL（2K2]無色桿菌屬（Photorhabdus）、色桿菌屬（Chromobacterium）和產堿菌屬（Alcaligenes）5個菌屬[3]。本研究中分離的假單胞菌屬和芽胞桿菌屬為常見菌屬，已在多種昆蟲[桑天牛（Apripona germari）、白蟻（Tsaitermes ampliceps）、蝗蟲（Atractomorpha sinensis）]中分離獲得，但分離得到的克雷伯氏菌屬的菌株研究還較少，有待進一步研究。

云南松毛蟲腸道中產脂肪酶菌群的酶活性表現不同，從中篩選得到了1株高產脂肪酶菌株P-50，屬于假單胞菌屬。以松節油為專一底物時，該菌株表現出較高的脂肪酶活性，并初步確定為中溫產堿性脂肪酶菌（最適作用溫度為35 ℃，最適pH值為8）這與鱗翅目昆蟲堿性腸道（pH值為8.0～100）環境相關聯。然而，P-50與已有高產酶菌株的酶活性相比還有很大的差距，有待進一步研究。

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