玫瑰黃鏈霉菌Men—myco—93—63產抗生素發酵培養基的優化

韓興+劉亞南+甄丹妹++劉大群+赤國彤

摘要：以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63為發酵菌株，采用Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗、中心復合試驗設計和響應面分析法，以抗生素產量為響應值，對其發酵培養基進行優化。首先，采用Plackett-Burman設計篩選出具有正顯著效應的花生餅粉和玉米漿。其次，通過最陡爬坡試驗逼近最大響應區域。最后，采用中心復合試驗對這2個因素進行優化。最終確定發酵的最適培養基含量配方為葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，花生餅粉4.96%，玉米漿2.66%，氯化鈉0.4%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.02%。優化后發酵培養基抗生素產量為2 030.6 mg/L，比優化前的771.9 mg/L 提高了1.63倍。

關鍵詞：玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63；發酵；抗生素；響應面分析

中圖分類號： S476+.8文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0100-03

玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus） Men-myco-93-63是從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離到的1株對多種植物病原菌具有抑制作用的拮抗鏈霉菌[1]。通過研究發現，該菌及其次生代謝產物對不同致病力的棉花黃萎病菌都有很強的抑制作用，可以導致黃萎病菌菌絲變形，并伴隨有溶菌作用[2-3]。溫室及大田試驗結果表明，其發酵液對棉花黃萎病有較好的田間防效[3]。趙志泉等從玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63發酵液中分離得到抑制棉花黃萎病菌的抗生素，并對其性質和結構進行了分析，但并未明確其具體結構[4]。張艷對玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的發酵培養基和發酵條件進行了研究，篩選出了較適宜的發酵培養基[5]。[JP]

Plackett-Burman法基于不完全平衡塊原理，能從眾多變量中快速篩選出最為重要的因素[6]。響應面方法（response surface methodology，RSM） 能將試驗設計和數學建模聯合起來，通過局部試驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關系[7]，得到準確有效的試驗結論。本試驗在前期試驗研究基礎上，以抗生素產量為目標響應值，通過一系列統計學方法，改良發酵培養基的組分含量，以期提高發酵過程中抗生素的產量。[JP]

1材料與方法

[HTK]1.1試驗材料[HT]

1.1.1供試菌株

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株，由河北農業大學植物保護學院分子植物病理學和植物病害生物防治實驗室保存。

1.1.2培養基

PDA培養基；初始發酵培養基含量配方：葡萄糖2.4%，可溶性淀粉0.8%，花生餅粉1.5%，玉米漿08%，氯化鈉0.4%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.02%。

1.2試驗方法

1.2.1發酵培養

將玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63在PDA培養基上培養 14 d 至孢子發育成熟，將孢子刮下，制成孢子懸浮液，調整孢子濃度為5×108 CFU/mL，向裝有100 mL發酵培養基的 500 mL 三角瓶中接入200 μL孢子懸浮液，在30 ℃、200 r/min 的搖床上振蕩培養5 d。

1.2.2抗生素標準曲線繪制

準確稱取0.010 3 g抗生素標準品，抗生素提取方法參照趙志泉等的方法[4]。加80%乙醇溶解，容量瓶中定容至 50 mL，得濃度為0.206 mg/mL的抗生素溶液，梯度稀釋8、10、12、14、16、32、64倍至濃度分別為0025 8、0.020 6 、0.017 2、0.014 7 、0.012 9、0.006 4、0.003 2 mg/mL，測定不同濃度溶液在363 nm處的吸光度，繪制標準曲線。

1.2.3抗生素含量測定方法

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63所產生的抗生素不溶于水，即存在于發酵液的沉淀中。將發酵液搖勻，取5 mL發酵液，加入20 mL乙醇，振蕩混勻，此時抗生素即溶于液相（含有80%乙醇）中，12 000 r/min離心 3 min，將上清液稀釋40倍，紫外分光光度計測其在 363 nm 處的吸光度，即為響應值。代入標準曲線中計算濃度。[JP]

1.2.4Plackett-Burman（PB）試驗

利用Design Expert 8.0.6.1 軟件，選取n=12的Plackett-Burman試驗設計，對初始發酵培養基中7個組分進行考察，試驗因素和水平見表1，試驗設計見表2。每個試驗點重復3次，取平均值。

1.2.5最陡爬坡試驗

1.2.7最優發酵培養基驗證

根據中心復合試驗和響應面分析得到的最優發酵培養基，以初始培養基為對照，進行發酵驗證試驗，重復5次，求其平均值。

2結果與分析

2.1抗生素標準曲線的繪制[HT]

以抗生素濃度為橫坐標（x），363 nm處的吸光度為縱坐標（y）作圖（圖1），得到線性回歸方程y=50.844x+0.050 6，r=0.999 5，在所測濃度范圍內線性關系良好。

2.2Plackett-Burman試驗設計與結果

PB試驗結果和方差分析分別如表2、表6所示，模型確

2.3最陡爬坡試驗設計與結果

由表6可知，花生餅粉含量和玉米漿含量都為正效應，效應系數分別為0.061和0.071，根據這2個因素的效應大小確定爬坡步長，其他不顯著因素均取低水平，試驗設計與結果如表3所示。由表3可知，D363 nm最大值出現在第2組試驗附近，因此將其作為后續中心復合試驗的中心點。

2.4中心復合試驗設計與結果

試驗共設13個試驗點，其中包括8個析因點和5個中心點，對試驗結果進行二次二元回歸擬合，得到回歸方程Y=0550-0.079C-0.038D-0.025CD-0.068C2-0.037D2，模型R=0.985 4，表明模型擬合良好，對回歸方程進行方差分析，P<0.000 1，模型極顯著，失擬項P=0.078 7不顯著，說明模型有意義，因此可用此模型分析預測響應值。同時，由表7可知，交互項CD的P=0.010 5，達到顯著水平，說明花生餅粉含量和玉米漿含量存在一定的交互作用，響應曲面及等高線圖如圖2所示，響應曲面存在極值點。

以363 nm處紫外吸光度最大即抗生素產量最大為目標，利用Design expert 8.0.6.1軟件對回歸方程求解極大值，得到最終優化結果為花生餅粉含量4.96%，玉米漿含量266%。在最佳優化條件下預測的最佳響應值為0.574 7。

2.5最優條件驗證

為了驗證預測值，按照優化后的條件進行驗證試驗，結果如表8所示。優化后D363 nm為0.566 8與預測值0.574 7非常接近，可見該模型能很好地預測發酵過程中抗生素的產量。將D363 nm代入標準曲線中，并按照稀釋濃度計算，可得優化后抗生素產量為2 030.6 mg/L，比優化前的771.9 mg/L提高了

3結論與討論

玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63對棉花黃萎病有較強的抑制作用，但利用發酵液進行生物防治在成本、運輸、保存等方面存在諸多不便，因此，從發酵液中提取分離得到抗生素尤為必要，而發酵培養基對抗生素的代謝合成有著重要影響[9]。因此本試驗通過改良發酵培養基來獲得更高的抗生素產量。

響應面法作為一種統計學方法，近年來已被廣泛應用于生物領域[10-13]，特別是發酵行業，相對于正交試驗只能對單個孤立的試驗點進行分析，響應面法在試驗條件尋優過程中可以連續地對試驗的各個水平進行分析，因而可以得到更為準確的最優條件。

本試驗利用Plackett-Burman試驗設計從初始發酵培養基中篩選出花生餅粉含量和玉米漿含量2個影響抗生素產量的主要因素。在此基礎上，通過最陡爬坡試驗找到其最優值區域，在花生餅粉含量為6%、玉米漿含量為3%附近。并以此為中心復合試驗設計的中心點，用響應曲面分析法確定花生餅粉含量和玉米漿含量的最佳因素水平分別為4.96%、266%。最后按照響應面優化的培養基進行驗證試驗，得到實際抗生素產量為2 030.6 mg/L，與模型預測值非常接近，并且，相對于初始發酵培養基的 771.9 mg/L，抗生素產量提高了1.63倍。

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江蘇農業科學2017年第45卷第10期

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