1株鱘源金黃桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

孔杰++李小義+王艷艷+曾圣+周洲

摘要：為研究鱘魚體內微生物多樣性，從貴州省水產研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚進行微生物的分離培養(yǎng)，從肝臟中分離純化獲得1株優(yōu)勢菌株，命名為菌株Liver 5。經(jīng)生理生化試驗、菌體形態(tài)觀察及16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。人工感染試驗表明，菌株Liver 5未引起鱘魚發(fā)病死亡現(xiàn)象。藥敏試驗結果表明，菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素中度敏感，對氯霉素、青霉素-G、鏈霉素及頭孢唑啉等21種抗生素均耐受。本研究結果對金黃桿菌引起的細菌性疾病用藥治療具有重要意義。

關鍵詞：金黃桿菌；抗生素；生理生化；病原菌

中圖分類號： S941.42文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0129-04

金黃桿菌屬為革蘭氏陰性、無鞭毛、嚴格好氧生長的一類菌屬，廣泛分布于水體和土壤中。腦膜膿毒金黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum）、產吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）及黏金黃桿菌（Chryseobacterium gleum）等是引起人體發(fā)病的常見條件致病菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥及呼吸道感染等疾病的發(fā)生[1]。部分金黃桿菌株還會造成魚蟹和畜禽等養(yǎng)殖動物體感染發(fā)病[2-4]。但Krause在研究金黃桿菌對蘿卜生長影響時發(fā)現(xiàn)，黏金黃桿菌對蘿卜抵抗病原菌具有積極作用[5]。Ramos在擬南芥植物根際細菌對植物抗病效果研究中發(fā)現(xiàn)菌株Chryseobacterium balustinum AUR9能顯著減少植株疾病發(fā)生[6]。近年來，金黃桿菌的產蛋白酶、抗氧化劑及生物防治劑等功效相繼有所報道。王繼元從無指盤臭蛙皮膚表面分離到1株產蛋白酶的金黃桿菌CW-E2T，并對其產胞外蛋白酶的特性進行了初步研究[7]。Kim等在研究金黃桿菌對植物病原菌拮抗機理中發(fā)現(xiàn)菌株Chryseobacterium wanjuense KJ9C8可通過產蛋白酶和HCN等物質對胡椒根際細菌菌群產生影響[8]。

鱘魚為高蛋白、高脂肪性魚類，是優(yōu)良的淡水魚品種，也是現(xiàn)存于世界上的最珍奇和最古老的冷水性生物魚群之一，其肉厚骨軟，同時鱘魚卵可以加工成鱘魚籽醬，具有“黑色黃金”之稱。魚體含有多種人體必需的氨基酸，具有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值。目前，對鱘魚體內微生物多樣性研究較少。本研究從貴州省水產研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚樣品，對其體內微生物進行了分離鑒定。旨在為了解鱘魚微生物多樣性、篩選有益微生物及細菌性疾病治療提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑

按常規(guī)方法自配LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基和水解酪蛋白瓊脂（MH）培養(yǎng)基；細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNApolymerase、dNTP等，購自TaKaRa公司；藥敏試紙片、細菌生化微量鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2樣品采集與菌株分離

2014年7月于貴州省水產研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚；無菌條件下取鱘魚肝臟，將肝臟組織在無菌生理鹽水中研磨均勻，適當稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，從中選取優(yōu)勢菌落進行純化，直至獲得純培養(yǎng)物。

回歸感染用的健康施氏鱘魚也來自該基地，健康施氏鱘魚放水族箱中暫養(yǎng)7 d，無異常后進行試驗。

1.3菌株鑒定

菌株Liver 5生理生化反應鑒定方法參照文獻[9]。

16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析：用細菌基因組DNA試劑盒提取單菌基因組DNA，擴增16S rRNA基因。16S rRNA基因正向擴增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第 8～27 個堿基位置）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向擴增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第1 512～1 493個堿基位置）：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′[10]。PCR擴增條件：95 ℃預變性5.0 min；94 ℃變性1.0 min，55 ℃復性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃，溫育 10 min。擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定條帶后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.4鱘魚人工感染試驗

選取健康的鱘魚進行人工注射感染試驗。菌株Liver 5過夜培養(yǎng)，取對數(shù)期菌液，離心收集菌體，用無菌PBS溶液洗滌2～3次，制備成菌懸液。腹腔注射菌濃度為9×108 CFU/mL，同時設置注射PBS液體的為對照組。取30尾體長為10～12 cm的鱘魚，每尾注射100 μL菌懸液。室溫下養(yǎng)殖連續(xù)養(yǎng)殖11 d，試驗期間持續(xù)充氧。每天觀察記錄各組鱘魚死亡情況。

1.5菌株Liver 5藥敏試驗

抗生素敏感試驗采用紙片法。將菌懸液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面，貼上抗生素試紙，28 ℃培養(yǎng)24 h，檢測記錄形成的敏感圈大小，以此判斷待測菌株對各種抗生素的敏感程度。試驗抗生素包括：頭孢噻肟、卡那霉素、羧芐青霉素、四環(huán)素、多黏菌素B、強力霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、麥迪霉素、鏈霉素、頭孢唑啉、頭孢曲松、新生霉素、阿米卡星、克林霉素、左氧氟沙星、慶大霉素、青霉素G、阿奇霉素、呋喃唑酮、妥布霉素、氨芐西林、新霉素、紅霉素、氯霉素。

2結果與分析

從貴州省水產研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚樣品，取其肝臟組織進行富集、分離和篩選，獲得1株優(yōu)勢菌株，命名為菌株Liver 5。以下試驗均以菌株Liver 5為試驗材料。

2.1菌株Liver 5的生理生化鑒定

對菌株Liver 5生理生化的各項指標進行檢測。由表1可知，在LB培養(yǎng)基上生長24 h菌株Liver 5菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，中間微隆，表面光滑且有光澤、金黃色，不透明。革蘭氏染色觀察顯示，菌株Liver 5為革蘭氏陰性菌，短桿狀。氧化酶、接觸酶呈陽性，能水解利用淀粉、木糖、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸等，但不能利用纖維素、棉籽山梨醇及尿素等。

2.2菌株Liver 5系統(tǒng)進化分析

提取菌株Liver 5總DNA，經(jīng)16S rRNA基因序列擴增測序得到1 167 bp片段的DNA序列，將所得序列在EZTaxon上進行序列比對，結果顯示菌株Liver 5與Chryseobacterium oncorhynchi 701B-08T相似性最高，為98.89%，其次為Chryseobacterium viscerum 687B-08T（98.32%）、Chryseobacterium artocarpi UTM-3T（97.79%）、Chryseobacterium jejuense JS17-8T（97.73%）等。結合其生理生化特性，初步鑒定其為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。采用MEGA 6.0分析軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

2.3鱘魚人工感染試驗

選取健康的鱘魚，檢驗菌株Liver 5對其的致病性。腹腔注射感染11 d，鱘魚無發(fā)病或死亡現(xiàn)象，表明菌株Liver 5對鱘魚無致病性。

2.4抗生素敏感性試驗

通過紙片法檢測了菌株Liver 5對24種抗生素的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素[CM（25]中度敏感，對氯霉素、青霉素-G、鏈霉素及頭孢唑啉等種抗生素均耐受（表2）。

3討論

目前，對金黃桿菌屬的研究多集中于其致病性方面。王世瑜等對分離獲得的172株產吲哚金黃桿菌抗藥性及臨床分布進行了分析，發(fā)現(xiàn)該菌表現(xiàn)出了多重耐藥性，且以呼吸道感染為主[15]。何樹光對216株金黃桿菌屬耐藥性分析結果表明，頭孢哌酮/舒巴坦對治療金黃桿菌屬細菌引起的感染具有較好效果[16]。此外，金黃桿菌在其他動植物的分布及致病性也有較多的研究。養(yǎng)殖歐洲鰻鱺鰓部金黃桿菌屬所占比例較高，為28.3%[17]。胡文舉等從產后1、8、15、22 d牛的子宮中均分離得到產吲哚金黃桿菌，其中產后1 d產吲哚金黃桿菌所占比例較高，為14.29%，僅次于藤黃微球菌所占比列（15.71%）[2]。棘胸蛙歪頭病死亡率高，其典型癥狀為歪頭，李明等對浙江麗水發(fā)病棘胸蛙致病菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血金黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum）是引起該病發(fā)生的致病菌，人工感染試驗4 d致死率達到100%，表明該菌株對棘胸蛙具有較強的致病性[18]。2014年重慶地區(qū)部分棘胸蛙養(yǎng)殖場出現(xiàn)棘胸蛙出血死亡的病例，吳寶紅等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)致病菌為金黃桿菌[19]。通過生理生化鑒定及16S rRNA序列分析，初步鑒定菌株Liver 5為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。鑒于金黃桿菌引起的養(yǎng)殖動物疾病時有發(fā)生，本研究對分離獲得的金黃桿菌Liver 5進行了鱘魚人工感染研究。人工注射感染試驗表明，菌株Liver 5對鱘魚無致病性。

隨著鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴大，各種疾病不斷出現(xiàn)，消毒劑和抗生素等傳統(tǒng)的疾病防治方法不能有效地預防疾病發(fā)生，同時隨著耐藥菌株及抗生素對人體危害等問題的發(fā)生，多個國家對抗生素藥物作為飼料添加劑均有限制，抗生素的應用也越來越受到重視。因此，在細菌性疾病暴發(fā)時，選擇針對性強的抗生素適量使用可以達到控制疾病進一步暴發(fā)并減少抗生素濫用的目的。研究表明，金黃桿菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類等抗生素耐受性較強[20]。本試驗選擇24種抗生素對菌株Liver 5的敏感性進行研究，[JP3]結果表明菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素中度敏感，可為金黃桿菌致病菌引發(fā)疾病用藥選擇提供參考。

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